中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ›› 2014, Vol. 32 ›› Issue (1): 1-01-05.
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韩世通，张青锋，潘卫庆
HAN Shi-tong, ZHANG Qing-feng, PAN Wei-qing*
摘要： 【摘要】 目的 鉴定恶性疟原虫ApiAP2蛋白家族成员PF3D7_1107800与var基因内含子保守序列（iNPE）存在体内相互结合作用。 方法 提取恶性疟原虫标准株3D7基因组DNA，PCR扩增PF3D7_1107800基因5′端片段。扩增产物经双酶切后连接入原核表达载体pGex-4T-1，重组质粒转化至大肠埃希菌（E. coli）BL21（DE3），异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）分析重组蛋白表达情况，谷胱甘肽亲和层析纯化重组蛋白。20只BALB/c小鼠分为重组蛋白免疫组和PBS对照组，每组10只，免疫组小鼠每鼠背部皮下注射纯化的重组蛋白100 μl（约含蛋白20 μg），对照组小鼠注射等量PBS，共免疫3次，每次间隔2周，末次免疫后2周处死小鼠，收集血清。重组纯化蛋白G（Protein G）纯化2组小鼠血清，Western blotting鉴定免疫血清抗体情况。染色质免疫沉淀（ChIP）获得恶性疟原虫DNA，qPCR检测PF3D7_1107800蛋白抗体组在C类var基因的内含子区域的富集情况。 结果 PCR扩增PF3D7_1107800基因5′端片段结果显示，在约345 bp处有一特异性条带，与理论值相符。重组表达载体pGEX-4T-1-PF3D7_1107800N经测序表明构建成功。重组蛋白经诱导表达和纯化后，SDS-PAGE和Western blotting结果显示，所获的重组蛋白为目的蛋白，其相对分子质量（Mr）约为37 000，与预测值一致。重组蛋白免疫小鼠后，获得抗体血清，Western blotting分析结果显示，血清中抗体可与重组蛋白特异结合，在约Mr 200 000处有一目的条带，与预测值一致。ChIP实验产物经qPCR分析显示，在var基因内含子区域的相对富集程度为内参seryl-tRNA合成酶基因区域的2倍以上。 结论 恶性疟原虫ApiAP2家族成员PF3D7_1107800可在体内与C类var基因内含子区域结合。
