多重PCR技术检测恶性疟原虫抗药性相关分子标志的方法研究

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ›› 2007, Vol. 25 ›› Issue (6): 4-456.

多重PCR技术检测恶性疟原虫抗药性相关分子标志的方法研究

张国庆,汤林华,官亚宜,周水森,郑彬,黄芳,武松,刘燕

中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室，世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心，上海 200025

收稿日期:1900-01-01 修回日期:1900-01-01 出版日期:2007-12-30 发布日期:2007-12-30
通讯作者: 汤林华

Multiplex PCR for Analysis of the Plasmodium falciparum Drug Resistance Molecular Markers

ZHANG Guo-qing,TANG Lin-hua,GUAN Ya-yi，ZHOU Shui-sen,ZHENG Bin,HUANG Fang,WU Song,LIU Yan

National Institute of Parasitic Diseases，Chinese Center for Disease Control and Prevention; Laboratory of Parasite and Vector Biology，Ministry of Health; WHO Collaborating Centre for Malaria，Schistosomiasis and Filariasis，Shanghai 200025，China

Received:1900-01-01 Revised:1900-01-01 Online:2007-12-30 Published:2007-12-30
Contact: TANG Lin-hua

摘要/Abstract

摘要： 目的建立恶性疟原虫5个主要抗药性相关基因的单管多重PCR扩增方法，用于恶性疟原虫抗药性分子标志检测。方法依据各基因参考序列，运用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件，设计5对特异性引物，采用Hot Start Taq DNA聚合酶，设置递增延伸温度，对恶性疟原虫标准株（3D7、Dd2和HB3）、分离株（FCC1/HN、 CMH/YN）、现场标本（来源于海南、云南和缅甸）、近缘虫种对照（间日疟原虫、伯氏疟原虫、食蟹猴疟原虫、杜氏利什曼原虫和牛源隐孢子虫）和空白对照（以H2O为模板）进行5个抗药性相关基因（包括恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因Pfcrt、多药抗性基因Pfmdr1、二氢喋酸合成酶基因Pfdhps、二氢叶酸还原酶基因Pfdhfr和三磷酸腺苷酶第6亚基基因PfATPase6）的单管多重PCR扩增，2%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果，测定扩增产物序列，并与参考序列（3D7株）比对。结果经电泳，恶性疟原虫标准株、分离株和现场标本的多重PCR扩增产物均可见5条目标条带。测序结果与参考序列比对，高度同源，最低同源性为98.5%。模板DNA量达0.1 ng即满足扩增要求，近缘虫种对照和空白对照未见扩增产物。结论多重PCR技术实现了单管1次反应完成5个抗药性相关基因的扩增，该方法灵敏，特异性好，有助于提高恶性疟原虫抗药性分子标志的检测效率。

关键词: 恶性疟原虫, 药物抗性, 单核苷酸多态性, 多重PCR

Abstract: Objective To develop a multiplex PCR protocol for amplification of five Plasmodium falciparum drug resistance related genes， thereby facilitate the rapid and high throughput analysis of the drug resistance molecular markers. Methods Five pairs of primers were designed according to the reference sequences by using Primer Premier 5.0 and Oligo 6.0 software. Drug resistance related genes， including P. falciparum chloroquine resistance transporter （Pfcrt）， multi-drug resistance 1 （Pfmdr1）， dihydropteroate synthetase （Pfdhps）， dihydrofolate reductase （Pfdhfr） and sarco/endo-plasmic reticulum Ca ²⁺-ATPase（PfATPase6）， were amplified by single-tube multiplex PCR using Hot Start Taq DNA Poly-merase among negative controls （P. vivax， P. berghei， P. cynomolgi， Leishmania donovani， Cryptosporidium andersoni），blank control （using H₂O as template）， as well as P. falciparum laboratory isolates （3D7， Dd2， HB3， FCC1/HN and CMH/YN） and field samples （collected from Yunnan， Hainan of China and Myanmar）. After amplification， the PCR products were analyzed by agarose gel electrophoresis. The sequencing results were aligned to the reference sequence using BLAST. Results Five expected bands at 315， 437， 514， 594 and 770 bp were obtained with no additional or nonspecific products in P. falciparum laboratory isolates and field samples. The sequencing results were identical with the reference sequence except the polymorphism sites， and exhibited more than 98.5% homology. The multiplex amplification was performed successfully starting from 0.1 ng of DNA template. No band was observed in negative controls and blank control. Conclusion The present study establishes a method to amplify five Plasmodium falciparum drug resistance related genes harboring 21 SNPs by one-tube reaction. The multiplex PCR protocol showing high specificity and sensitivity is more convenient and efficient in analyzing the P. falciparum drug resistance molecular markers as compared with traditional nested PCR.

Key words: Plasmodium falciparum, Drug resistance, Single nucleotide polymorphism, Multiplex polymerase chain reaction

张国庆;汤林华;官亚宜;周水森;郑彬;黄芳;武松;刘燕. 多重PCR技术检测恶性疟原虫抗药性相关分子标志的方法研究[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2007, 25(6): 4-456.

ZHANGGuo-qing;TANGLin-hua;GUANYa-yi;ZHOUShui-sen;ZHENGBin;HUANGFang;WUSong;LIUYan. Multiplex PCR for Analysis of the Plasmodium falciparum Drug Resistance Molecular Markers[J]. Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases, 2007, 25(6): 4-456.

[1]	周瑞敏, 纪鹏慧, 李素华, 杨成运, 刘颖, 钱丹, 邓艳, 鲁德领, 赵玉玲, 赵东阳, 张红卫. 河南省自赤道几内亚输入的恶性疟原虫抗药性基因多态性分析[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2023, 41(5): 593-600.
[2]	徐少杰, 陈绅波, 陈军虎. 恶性疟原虫重复散布家族基因转录调控的研究进展[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2023, 41(3): 374-379.
[3]	韦开文, 曾红霞, 何牧, 胡俊杰. 浣熊贝氏蛔虫核糖体基因和线粒体基因分析[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2022, 40(5): 594-602.
[4]	罗晓平, 李军燕, 高娃, 耿万恒, 王瑞, 胡薇, 乔蕾, 邵国玉, 杨晓野. 捻转血矛线虫耐伊维菌素候选基因的多态性分析[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2022, 40(4): 536-539.
[5]	江莉, 张耀光, 刘红霞, 王真瑜, 朱民, 吴寰宇. 疟疾蚊媒监测多重PCR方法的建立[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2022, 40(2): 159-167.
[6]	田斌, 廖瑜, 文岚, 肖芳, 张兵, 申晓君. 长沙市122例输入性恶性疟原虫多药抗性基因1拷贝数变异分析[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2022, 40(1): 127-131.
[7]	石明丽, 肖波, 江陆斌. 恶性疟原虫var基因的表达调控机制研究进展[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2021, 39(6): 719-724.
[8]	史善美, 陈军虎. 恶性疟原虫RIFIN蛋白的结构和功能研究进展[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2021, 39(2): 249-255.
[9]	张苍林, 聂仁华, 徐丹, 吕高伟, 王剑, 杨亚明, 邓艳, 刘言, 周红宁. 中缅边境地区恶性疟原虫Pfcrt、Pfmdr和PfK13基因多态性与体外药物敏感性相关性的分析[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2020, 38(5): 580-588.
[10]	叶升玉, 成依依, 李曼, 周红宁. 我国恶性疟原虫主要药物抗性研究[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2020, 38(5): 631-636.
[11]	周水茂, 涂祖武, 杨燕, 陈芳, 贾西帅. 环介导等温扩增检测恶性疟原虫与其他疟原虫的效果评价[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2020, 38(4): 423-428.
[12]	叶升玉, 成依依, 李曼, 周红宁. 恶性疟原虫抗药性分子标记检测方法研究进展[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2020, 38(4): 490-495.
[13]	李仁清, 王小梅, 孙玉兰, 吕燕宁, 窦相峰, 王全意. 宏基因组学二代测序技术在输入性疟疾诊断中的应用[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2019, 37(6): 727-729.
[14]	牟畇珊, 李璐杰, 吴银娟, 李学荣. 疟原虫青蒿素耐药分子机制探索[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2018, 36(6): 636-642.
[15]	刘纯, NdoumadiambaALFRED, MounzieGouGNONDA. 胶体金恶性疟原虫检测试剂盒在非洲加蓬的临床应用[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2018, 36(6): 679-680.