中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ›› 2025, Vol. 43 ›› Issue (1): 103-111.doi: 10.12140/j.issn.1000-7423.2025.01.016
殷荷1,2(), 马磊3, 党甜甜1,2, 李佳铭1,2, 赵志军1,2,*(
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YIN He1,2(), MA Lei3, DANG Tiantian1,2, LI Jiaming1,2, Zhao Zhijun1,2,*(
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摘要:
目的 探究刚地弓形虫Ⅰ、Ⅲ型棒状体蛋白16(ROP16)通过调控TATA结合蛋白相关因子15(TAF15)对人单核细胞白血病细胞(THP-1)增殖、凋亡的影响及作用机制。方法 将Ⅰ、Ⅲ型ROP16过表达慢病毒转染至THP-1细胞,构建稳定表达ROP16的细胞株(THP-1-ROP16Ⅰ/Ⅲ),以转染空载体慢病毒的细胞为空载体对照组(THP-1-Venus),未转染细胞为对照组(THP-1),通过实时荧光定量逆转录PCR(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)验证过表达效果。利用免疫沉淀-质谱联用技术(IP-MS)在THP-1-ROP16Ⅰ/Ⅲ细胞株中预测ROP16的互作蛋白,并通过RT-qPCR和Western blotting检测细胞中互作蛋白TAF15的表达。将3条作用于TAF15基因不同位点的小干扰RNA(siRNA 1215、siRNA 825、siRNA 288)分别干扰THP-1-ROP16Ⅰ/Ⅲ细胞株,分为THP-1-ROP16Ⅰ/Ⅲ + siRNA 1215/825/288组,同时设未干扰对照组(THP-1-ROP16Ⅰ/Ⅲ + siRNA NC),Western blotting验证TAF15沉默效果。通过细胞计数试剂盒8(CCK-8)与流式细胞术检测各组细胞增殖及凋亡情况,Western blotting检测细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(p21)、周期素依赖性激酶6(CDK6)、G1/S特异性周期蛋白(CyclinD1)、B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、裂解型半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶-9(caspase-9)及磷酸化信号转导和转录激活因子3(P-STAT3)蛋白的表达。结果 THP-1-ROP16Ⅰ/Ⅲ组ROP16 mRNA的相对转录水平为2 679.427 ± 250.600、2 395.410 ± 325.700,均高于THP-1-Venus组(1.036 ± 0.102)(F = 153.3,P < 0.01);ROP16蛋白的相对表达水平为4.526 ± 0.020、5.457 ± 0.250,均高于THP-1-Venus组(1.688 ± 0.653)(F = 76.4,P < 0.01)。TAF15为Ⅰ、Ⅲ型ROP16的互作蛋白,THP-1-ROP16Ⅰ/Ⅲ组TAF15 mRNA的相对转录水平为6.027 ± 0.313、5.567 ± 0.088,均高于THP-1-Venus组(0.985 ± 0.027)(F = 869.4,P < 0.01);TAF15蛋白的相对表达水平为1.789 ± 0.145、1.593 ± 0.029,均高于THP-1-Venus组(1.010 ± 0.365)(F = 50.6,P < 0.01)。TAF15 siRNA转染48 h后,THP-1-ROP16Ⅰ + siRNA 1215/825/288组TAF15蛋白的相对表达水平分别为0.384 ± 0.047、0.246 ± 0.072、0.125 ± 0.026,均低于THP-1-Venus组(1.007 ± 0.019)(F = 313.1,P < 0.01);THP-1-ROP16Ⅲ + siRNA 1215/825/288组细胞TAF15蛋白的相对表达水平分别为0.186 ± 0.020、0.180 ± 0.015、0.112 ± 0.019,均低于THP-1-Venus组(0.995 ± 0.052)(F = 3046.0,P < 0.01)。THP-1-ROP16Ⅰ/Ⅲ + siRNA NC组细胞CCK-8实验A450值分别为0.803 ± 0.015、0.813 ± 0.011,低于THP-1-Venus组(0.997 ± 0.010、0.995 ± 0.016)(t = 19.2、24.0,均P < 0.01);THP-1-ROP16Ⅰ/Ⅲ + siRNA 825/288组A450值分别为0.986 ± 0.010、0.983 ± 0.004,0.980 ± 0.006、0.984 ± 0.010(F = 3.5、2.9,均P > 0.05)。THP-1-ROP16Ⅰ/Ⅲ + siRNA NC组细胞凋亡率分别为(38.19 ± 0.45)%、(38.06 ± 0.84)%,高于THP-1-Venus组的(28.41 ± 0.69)%(t = 20.5、17.7,均P < 0.01);THP-1-ROP16Ⅰ/Ⅲ + siRNA 825/288组分别为(30.03 ± 1.83)%、(28.78 ± 0.72)%,(29.33 ± 0.80)%、(28.94 ± 0.58)%(F = 1.5、0.4,均P > 0.05)。THP-1-ROP16Ⅰ + siRNA NC组p21、Bax、caspase-9、cleaved caspase-3及P-STAT3蛋白的相对表达水平分别为1.322 ± 0.027、1.493 ± 0.030、1.349 ± 0.021、1.324 ± 0.020、10.500 ± 1.005,均高于THP-1-Venus组(1.000 ± 0.026、0.996 ± 0.016、0.989 ± 0.019、0.994 ± 0.010、1.000 ± 0.001)(t = 14.8、25.4、22.3、25.0、15.6,均P < 0.01);CDK6、CyclinD1及Bcl-2蛋白的相对表达水平分别为0.387 ± 0.040、0.424 ± 0.030、0.438 ± 0.035,均低于THP-1-Venus组(0.989 ± 0.018、1.000 ± 0.074、0.991 ± 0.016)(t = 23.6、12.4、25.0,均P < 0.01)。THP-1-ROP16Ⅲ + siRNA NC组p21、Bax、caspase-9、cleaved caspase-3及P-STAT3蛋白的相对表达水平分别为1.409 ± 0.020、1.493 ± 0.030、1.349 ± 0.021、1.324 ± 0.020、16.210 ± 0.664,均高于THP-1-Venus组(1.004 ± 0.032、0.996 ± 0.015、0.989 ± 0.019、0.994 ± 0.010、1.000 ± 0.001)(t = 18.7、25.4、22.3、25.0、39.7,均P < 0.01);CDK6、CyclinD1及Bcl-2蛋白的相对表达水平分别为0.418 ± 0.021、0.357 ± 0.040、0.411 ± 0.019,均低于THP-1-Venus组(1.000 ± 0.001、1.001 ± 0.042、0.991 ± 0.016)(t = 47.7、19.1、40.7,均P < 0.01)。结论 弓形虫Ⅰ、Ⅲ型ROP16蛋白可通过促进TAF15的表达抑制THP-1细胞增殖、促进细胞凋亡,其作用机制可能与抑制细胞内STAT3信号通路的活化有关。
中图分类号: