周洪昌*, 张慧, 李小余, 郭跃, 姚韵靓, 王莎
ZHOU Hong-chang*, ZHANG Hui, LI Xiao-yu, GUO Yue, YAO Yun-liang, WANG Sha
摘要:
目的 分析恶性疟原虫二氢乳清酸脱氢酶(Plasmodium falciparum dihydroorotate dehydrogenase, PfDHODH)抑制剂(二氢噻吩酮类化合物, 编号50, 以下简称PfDHODH抑制剂50)对体外培养恶性疟原虫的作用特点及其诱导耐药的可能机制。 方法 恶性疟原虫氯喹敏感株(3D7株)和氯喹抗性株(Dd2株)同步化培养后分为不加药对照组、环状体期加药组和大滋养体期加药组, 药物终浓度为80 nmol/L。分别在同步化后0 h(环状体期)、24 h(大滋养体期)、42 h涂薄血膜片镜检; 通过逐步加大药物浓度的方法, 体外诱导产生耐药虫株, 3个月后经有限稀释培养, 获得单克隆耐药虫株。采用SYBR Green Ⅰ染料法检测各耐药虫株对PfDHODH抑制剂50、氯喹和青蒿素的半数抑制浓度(IC50); PCR扩增各耐药虫株Pfdhodh基因并测序, 分析其突变情况。 结果 与不加药对照组相比, 环状体期加药组恶性疟原虫从滋养体到裂殖体的发育受到明显抑制, 大滋养体期加药组恶性疟原虫呈现明显的空泡化, 核质密度大大降低。通过体外诱导并经有限稀释培养, 获得44株PfDHODH抑制剂50的单克隆耐药虫株, 其中, 母本为Dd2、3D7的耐药虫株分别为24和20株, 它们对PfDHODH抑制剂50的IC50分别为(2.284±0.096)和(0.678±0.018)μmol/L, 较母本虫株的(0.018±0.002)和(0.015±0.002)μmol/L分别提高了近130倍和50倍; 对氯喹和青蒿素的IC50分别为(0.011±0.002)、(0.014±0.004)和(0.013±0.003)、(0.012±0.001)μmol/L; 与母本Dd2虫株相比, Dd2耐药虫株对氯喹的IC50从(0.072±0.002)μmol/L下降为(0.011±0.002)μmol/L。测序分析结果显示, 23株Dd2来源的耐药虫株PfDHODH蛋白氨基酸序列发生了G181D的点突变, 另有1株除G181D的点突变外, 还产生了K32N的点突变; 3D7来源的耐药虫株未发现相应突变。 结论 体外诱导获得PfDHODH抑制剂50的单克隆耐药虫株, G181D的点突变可能是导致恶性疟原虫高水平耐受PfDHODH抑制剂50的重要分子机制。