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2017年 第35卷 第3期    刊出日期：2017-06-30

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专题报道

封面和目录

2017, 35(3):  1. 

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消息

中华预防医学会医学寄生虫分会青年委员会成立大会暨2017年全国医学寄生虫学学术研讨会

2017, 35(3):  24-封二. 

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论著

利用sgRNA串联表达框架编辑恶性疟原虫K13和NUP116基因的研究

孟令文, 赵月蒙, 夏惠, 方强, 张青锋

2017, 35(3):  197-201. 

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目的 利用单链引导RNA（sgRNA）串联表达框架编辑恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)K13和NUP116基因。 方法 根据恶性疟原虫K13和NUP116基因序列设计引物,PCR扩增K13和NUP116基因的同源臂,并引入突变位点。PCR串联基因K13和NUP116的sgRNA,将同源臂和串联的sgRNA与载体pL6cs连接,构建用于电击转染实验的载体pL6-K13-NUP116,将其与表达Cas9蛋白的质粒一同通过电击转染法,转入恶性疟原虫体内,利用成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9（CRISPR/Cas9）系统对基因进行编辑修饰,通过筛选药物二氢叶酸还原酶抑制剂（WR）和杀稻瘟菌素（BSD）筛选转基因疟原虫,提取转基因疟原虫的基因组,对其进行PCR检测,最终通过测序鉴定K13和NUP116基因是否成功被突变修饰。 结果 PCR扩增出K13和NUP116串联的同源臂（K13全长557 bp,NUP116全长569 bp）以及串联的sgRNA,与载体pL6cs连接后成功获得用于电击转染实验的表达载体pL6-K13-NUP116。电击转染后通过药物筛选转基因疟原虫,培养至第28天涂片镜检发现疟原虫。PCR检测结果显示,转基因疟原虫K13和NUP116基因突变修饰成功。测序表明,K13和NUP116基因的目标位点被成功突变。 结论 基于CRISPR/Cas9编辑技术的串联sgRNA表达载体可同时对恶性疟原虫K13和NUP116基因进行编辑.

云南省恶性疟原虫氯喹及青蒿素抗性相关基因的联合突变分析

董莹, 孙艾明, 邓艳, 陈梦妮, 徐艳春, 毛祥华

2017, 35(3):  202-208. 

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目的 分析云南省恶性疟原虫抗氯喹转运蛋白（Plasmodium falciparum chloroquine resistant transporter, Pfcrt）基因和青蒿素抗性相关（K13）基因的联合突变特性。 方法 收集2012年8月-2015年12月寄生虫病防治信息管理系统登记和报告的云南省恶性疟病例滤纸血样和流行病学史等相关信息,提取疟原虫DNA,巢式PCR扩增恶性疟原虫Pfcrt基因exon2区和K13基因kelch结构域并测序,测序序列与2655199、PF3D7_1343700参比序列进行比对,用MEGA 5.04、Arlequin 3.01软件分析Pfcrt基因exon2区、K13基因kelch结构域的单倍型、单倍型间期望杂合度（He）及其群体间的遗传分化指数（Fst）等,用Network 4.6.0软件制作单倍型中介网络进化图,采用Epi Data 3.1软件建立数据库,SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。 结果 共收集恶性疟病例血样234份,Pfcrt基因exon2区、K13基因kelch结构域巢式PCR扩增产物同时成功测序192份。其中,云南省本地感染病例血样12份,自非洲、缅甸感染的病例血样分别为30和150份。218份血样的Pfcrt基因exon2区DNA序列有7种单倍型,He为0.238 5,错义突变序列占83.0%（181/218）,72~76位点呈单重突变（CVMNT）、双重突变（SVMNT）、三重突变（CVIET）的比例分别为1.8%（4/218）、6.4%（14/218）和74.8%（163/218）,7种单倍型以氯喹敏感型CVMNK为起始,再按单重、双重及三重突变的路径逐步进化。192份血样的K13基因kelch结构域DNA序列有21种单倍型,He为0.044 9,错义突变序列占35.9%（69/192）,在16、446、676等9个位点均只发生单重突变,F446I的突变率最高,为25.0%（48/192）,21种单倍型的中介网络图显示“星状”布局。云南省本地恶性疟原虫种群与缅甸种群间的Fst最小,为0.020 3。Pfcrt基因的氯喹敏感型CVMNK血样中,K13基因kelch结构域位点突变的比例为20.6%（7/34）,氯喹抗性型CVMNT、CVIET血样中的检出比例分别为1/4和36.4%（51/140）。 结论 云南省疫情报告病例中恶性疟原虫的氯喹、青蒿素相关抗性基因的联合突变率为27.1%,且青蒿素抗性基因突变型之间可能存在种群扩张模式.

中缅边境及泰国东南地区恶性疟原虫K13基因侧翼微卫星多态性研究

陈学迪, 叶润, 潘卫庆

2017, 35(3):  209-212. 

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目的 研究中缅边境拉咱地区和泰国东南Srisaket、Trat和Ranong等3个地区恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）K13基因侧翼微卫星的多态性。 方法 取前期经基因型研究的恶性疟原虫样品42份,其中中缅边境拉咱地区22份（K13基因R539T突变型和野生型各11份）,泰国3个地区20份（K13基因R539T突变型9份和野生型11份）,对上述样品K13基因上游31 900、6 360、150 bp和下游1 700、11 000、31 500 bp共6个位点的微卫星片段进行PCR扩增,PCR产物经毛细管电泳仪检测片段长度,并采用Bio Calculator软件进行数据分析,GenALEx软件计算等位基因频率和期望杂合度（He）。 结果 中缅边境拉咱地区和泰国3个地区恶性疟原虫虫株K13基因两侧的6个微卫星位点共检测到46个等位基因,在上游6 360 bp位点的等位基因长度分别集中在286和278 bp,等位基因频率为73%和67%。上游31 900 bp位点等位基因长度分别集中在211和205 bp,等位基因频率为55%和44%。上游150 bp及下游1 700 bp位点等位基因长度主要集中在195和209 bp,其他两个位点未出现集中分布的情况。中缅边境拉咱地区虫株的单倍体型为H1至H4型,泰国3个地区虫株除了2株H2单体型外,其余均为H5和H6型。42份样品的6个微卫星位点的平均He分别为0.49 ± 0.23、0.42 ± 0.33和0.72 ± 0.12、0.67 ± 0.11。R539T突变的虫株在毗邻K13基因的微卫星位点处He明显降低,在上游150 bp处分别为0.17和0,在下游1 700 bp处分别为0.3和0。 结论 中缅边境拉咱地区及泰国3个地区K13基因为R539T突变型的恶性疟原虫虫株均受到青蒿素选择压力,等位基因型在上游6 360和31 900 bp两个位点上具有明显的差异.

慢病毒介导的绿色荧光蛋白基因在日本血吸虫体内的成功表达

赵楠, 李青, 胡薇

2017, 35(3):  213-217. 

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目的 了解日本血吸虫（Schistosoma japonicum）体内能否表达外源绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）,并产生绿色荧光。 方法 构建pEGFP-LacZ-C1融合蛋白表达质粒,以聚乙烯亚胺（polyethylenimine,PEI）为转染试剂,分别转染哺乳动物293T细胞和感染小鼠后14 d的日本血吸虫童虫,未转染阴性对照组不做任何处理;转染后48 h,在荧光显微镜下观察被转染的293T细胞和日本血吸虫童虫是否有GFP绿色荧光产生;对被转染的293T细胞和日本血吸虫童虫进行β-半乳糖苷酶原位染色,在光学显微镜下观察是否有蓝色产物产生。同时,将日本血吸虫童虫放入培养293T细胞的12孔板中,分别在光学显微镜和荧光显微镜下观察。用未稀释的、滴度为3 × 10⁸菌落形成单位(CFU)/ml的慢病毒体外感染日本血吸虫童虫和293T细胞96 h后,在荧光显微镜下观察是否有GFP绿色荧光产生。 结果 pEGFP-LacZ-C1转染293T细胞后,可以观察到GFP绿色荧光,β-半乳糖苷酶原位染色后也可以观察到蓝色的斑点,而在对照组和日本血吸虫童虫中,均未观察到GFP荧光和蓝色斑点。日本血吸虫童虫和293T细胞GFP荧光的比较发现,293T细胞发出的GFP荧光亮度明显高于日本血吸虫童虫的自发荧光,且293T细胞GFP荧光为艳绿色,而日本血吸虫童虫的自发荧光为黄绿色。在慢病毒感染实验中,未稀释的慢病毒感染96 h后,在荧光显微镜下可以清晰地看到血吸虫肠道外围组织中有许多艳绿色的荧光亮点,日本血吸虫童虫GFP的颜色及亮度与293T细胞中的基本一致,且荧光亮点的移动与虫体的肌肉运动基本保持一致。 结论 日本血吸虫童虫的背景荧光在外源GFP表达充足的情况下并不会影响荧光的观察。未稀释的慢病毒感染日本血吸虫童虫96 h后可提高转染效率,增加GFP表达量,在体内观察到GFP的绿色荧光.

四种刺激剂对日本血吸虫感染小鼠脾脏CD8⁺ T细胞内细胞因子及表面分子CD62L的影响

郑力, 胡媛, 王燕娟, 黄希宝, 沈玉娟, 徐馀信, 巩文词, 蔡顺祥, 曹建平

2017, 35(3):  218-223. 

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目的 探讨4种常用刺激剂佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate,P）、离子霉素（ionomycin,I）、布雷非德菌素A（brefeldin A,B）和莫能霉素（monensin,M）对日本血吸虫（Schistosoma japonicum）感染小鼠脾脏CD8⁺ T细胞内细胞因子及表面分子CD62L的影响。 方法 21只C57BL/6雌性小鼠腹部贴片法感染日本血吸虫尾蚴,（20 ± 2）条/鼠。感染后第8周和第12周,分别取小鼠脾脏制备单细胞悬液,用P（50 ng/ml）+ I（1 μmol/L）+ M（2 μmol/L）体外刺激4 h,采用流式细胞术检测分泌γ干扰素（IFN-γ）的CD8⁺ T细胞比例,同时检测细胞表面CD62L的表达情况。制备感染后4周的小鼠脾脏单细胞悬液,按I组（1 μmol/L）、P组（50 ng/ml）、B组（1 μg/ml）、M组（2 μmol/L）、P + I组、P + I + M组、P + I + B组、P + I + M + B组分组,用对应刺激剂体外刺激4 h后,利用细胞因子微球检测法检测各组培养上清中白细胞介素4（IL-4）、IL-17A、IFN-γ、IL-10、IL-1β和集落刺激因子（G-CSF）等细胞因子水平,同时用流式细胞术检测CD8⁺ T细胞表面CD62L的表达情况,计算平均荧光强度（MFI）。 结果 流式细胞术检测结果显示,小鼠感染日本血吸虫后第8周和第12周,产生IFN-γ的CD8⁺ T细胞比例分别降至（1.3 ± 0.8）%和（0.7 ± 0.2）%,均低于未感染对照组的（5.6 ± 0.8）%（P < 0.05）,但两者差异无统计学意义（P > 0.05）。健康对照组和感染组小鼠CD8⁺ T细胞表面均未检测到CD62L阳性群。不同组合刺激剂作用感染后4周,小鼠脾脏细胞培养上清细胞因子的检测结果显示,P + I组和P + I + M组的IL-4水平分别为（177.2 ± 56.0）和（13.7 ± 2.2）pg/ml;P + I组和P + I + M组的IL-17A浓度分别为（361.8 ± 81.3）和（33.7 ± 2.9）pg/ml;P + I组和P + I + M组上清中的IFN-γ浓度分别为（1 534.0 ± 316.6）和（135.3 ± 16.1）pg/ml;P + I组、P组和I组上清中IL-10的浓度分别为（705.5 ± 179.6）、（34.8 ± 13.9）和（43.1 ± 13.9）pg/ml;P组和P + I组中G-CSF的浓度为（44.6 ± 8.0）和（21.7 ± 2.9）pg/ml;P组、I组和P + I + M组中IL-1β的浓度分别为（3.9 ± 1.0）、（6.4 ± 0.2）和（3.7 ± 0.3）pg/ml;上述各组与其对应的对照组比较,差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。流式细胞术检测结果显示,P + I组、P + I + B组、P + I + M组和P + I + B + M组中CD62L峰较对照组明显左移,MFI分别为2.7 ± 0.1、2.6 ± 0.2、2.5 ± 0.1、2.5 ± 0.1,低于对照组（P < 0.01）。 结论 日本血吸虫感染晚期,小鼠脾脏细胞产生IFN-γ的CD8⁺ T细胞比例减少,经P + I刺激后,CD62L表达明显下调.

库普弗细胞在小鼠日本血吸虫肝病发展过程中的表型变化

孙悦, 郑葵阳, 何兴, 雷南行, 颜超, 汤仁仙

2017, 35(3):  224-229. 

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目的 研究库普弗细胞（Kupffer cell）在小鼠日本血吸虫（Schistosoma japonicum）肝病发展过程中的表型变化。 方法 将20只6周龄的BALB/c雄性小鼠经腹部皮肤感染16条日本血吸虫尾蚴,在感染后0、21、32、42、52 d分别处死小鼠,取肝脏组织,HE染色和Masson三色染色观察肝脏病理变化,实时定量PCR（qPCR）检测肝脏Th1型细胞因子γ干扰素（interferon-γ,IFN-γ）、α肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、Th2型细胞因子白细胞介素-4（interleukin-4,IL-4）、IL-13、IL-10)以及库普弗细胞的M1型巨噬细胞分化标志物诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthetase,iNOS）、白细胞分化抗原16（cluster of differentiation 16,CD16）、IL-6和M2型巨噬细胞分化标志物精氨酸酶-1（arginase 1,Arg-1）、CD206、IL-10的表达。体外培养库普弗细胞系,分别给予0、5、25、50 ng/ml IFN-γ或IL-4刺激12 h,或者给予25 ng/ml IFN-γ或IL-4分别刺激0、12、24、36 h后,qPCR检测库普弗细胞M1型、M2型巨噬细胞分化标志物。 结果 HE染色和Masson三色染色结果显示,小鼠感染后32 d肝组织中开始有虫卵沉积,42 d有明显的肉芽肿和纤维化病变。qPCR结果显示,与感染后0 d相比,IFN-γ在32 d表达水平最高,相对表达量为29.243 ± 3.245,52 d时迅速下降,为8.923 ± 3.002。IL-4在42 d最高,为25.521 ± 4.957。IL-13在52 d最高,为50.793 ± 9.631（均P < 0.05）。iNOS在42 d表达水平上升,相对表达量为2.950 ± 0.321,在52 d下降,为1.783 ± 0.319。Arg-1在52 d最高,为2.003 ± 0.152（均P < 0.05）。0、5、25、50 ng/mlIFN-γ刺激库普弗细胞12 h后,iNOS、IL-6和CD16的相对表达量分别为54.690~68.577、1.887~2.427、2.417~2.787（均P < 0.05）。25 ng/ml IFN-γ刺激0、12、24、36 h后,iNOS、IL-6和CD16的相对表达量分别为34.810~109.210、10.327~15.143、1.887~3.317（均P < 0.05）,而Arg-1与对照组相比无明显变化。0、5、25、50 ng/ml IL-4刺激库普弗细胞12 h后,Arg-1、IL-10和CD206的相对表达量分别为9.153~24.253、1.923~3.687和37.770~72.133（均P < 0.05）;25 ng/mlIL-4刺激0、12、24、36 h后Arg-1、IL-10和CD206的相对表达量分别为3.563~12.613、1.637~2.673和19.732~71.943（均P < 0.05）,而iNOS无明显变化。 结论 在日本血吸虫感染早期,库普弗细胞以M1型为主;而在感染中晚期,库普弗细胞以M2型为主,表明库普弗细胞转变与肝脏免疫微环境密切相关.

环介导等温扩增法检测粪样中日本血吸虫虫卵DNA的效果评估

冯婷, 秦志强, 许静, 周杰, 钱颖骏, 祝红庆, 吕山, 曹淳力, 李石柱

2017, 35(3):  230-234. 

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目的 评估环介导等温扩增（loop mediated isothermal amplification,LAMP）法检测粪样中日本血吸虫（Schistosoma japonicum）虫卵DNA的效果,并评价其检测流行区现场牛野外粪样的效果。 方法 取1 g新鲜的日本血吸虫虫卵阴性牛粪,分别加入5个新鲜日本血吸虫虫卵、50 μl日本血吸虫虫卵排泄分泌产物（egg secretion product,ESP）制备人工模拟阳性粪样。用粪DNA提取试剂盒分别提取加入虫卵的未经研磨或研磨 2 min后的人工模拟阳性粪样、加入虫卵ESP的粪样和阴性粪样的DNA,以日本血吸虫28S核糖体 DNA (rDNA)为检测靶基因,用LAMP法、PCR法检测,评估LAMP法检测粪样中日本血吸虫虫卵DNA的效果。收集2012-2014年湖南、湖北、江西、安徽等4省日本血吸虫病流行区的牛野外粪样221份,研磨后同法提取DNA,用LAMP法检测,并与PCR法、孵化法的检测结果进行比较,评价其检测流行区现场野外粪样的效果。 结果 LAMP法检测加入虫卵粪样并经研磨后提取的DNA、加入虫卵ESP粪样提取的DNA均为阳性反应,呈绿色;而加入虫卵粪样未经研磨提取的DNA、阴性粪样DNA则为阴性反应,呈棕色;PCR检测的结果与LAMP法检测结果相近。LAMP法、PCR法和孵化法检测血吸虫病流行区牛野外粪样的阳性率分别为5.43%（12/221）、4.52%（10/221）、0.90%（2/221）。LAMP法的阳性率明显高于孵化法（P < 0.05）,LAMP法与PCR法阳性率差异无统计学意义 (P > 0.05)。 结论 LAMP法可用于检测流行区现场野外粪样的日本血吸虫虫卵DNA,其现场应用价值有待进一步验证.

消息

中华预防医学会医学寄生虫分会关于召开2017年全国医学寄生虫学学术研讨会第一轮预通知

2017, 35(3):  234-234. 

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论著

氯硝柳胺原位固化长效注射剂对感染日本血吸虫小鼠和水牛的预防效果

姜斌, 张皓冰, 薛剑, 陶奕, 贾铁武, 殷梦, 霍乐乐, 刘妮, 周晓农

2017, 35(3):  235-238. 

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目的 观察氯硝柳胺原位固化长效注射剂对感染日本血吸虫（Schistosoma japonicum）的小鼠和水牛的疗效。 方法 50只昆明小鼠随机均分为2组,给药组小鼠皮下注射低浓度氯硝柳胺原位固化长效注射剂（71 mg/ml）450 mg/kg 1次,对照组小鼠不作任何处理。给药后第1、15、43、57和71天,各组分别取5只小鼠采用腹部贴片法感染日本血吸虫尾蚴（80 ± 4）条/鼠。35 d后,处死小鼠,检获成虫,计算减虫率。10头水牛分成2组,给药组4头、对照组6头。给药组水牛皮下注射高浓度氯硝柳胺原位固化长效注射剂（222 mg/ml）30 mg/kg 1次,对照组水牛不作任何处理。于给药后第1和3个月粪检,计算粪检阳性率,并观察水牛的不良反应。采用SPSS19.0软件进行统计学分析,组间比较采用t检验。 结果 给药后第1、15、43、57和71天感染日本血吸虫尾蚴,35 d后给药组小鼠的虫荷分别为（3.6 ± 1.4）条、（17.5 ± 8.6）条、（10.0 ± 6.8）条、0 条、（11.3 ± 8.4）条,均少于对照组小鼠的虫荷（P < 0.05）,且减虫率均超过50.0%。第1和3个月对水牛进行粪检,给药组均为阴性,对照组分别有2和3头阳性,其中1头牛给药后8 h出现精神沉郁。 结论 氯硝柳胺原位固化长效注射剂预防小鼠感染日本血吸虫尾蚴的作用达2个月,预防水牛感染日本血吸虫尾蚴的作用达3个月,具有现场应用预防血吸虫感染的潜力.

广东省南澳岛福寿螺和鼠类密度及其广州管圆线虫感染现状调查

胡求安, 张仪, 郭云海, 吕山, 夏尚, 刘和香

2017, 35(3):  239-245. 

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目的 了解广东省南澳岛广州管圆线虫（Angiostronglyus cantonensis）中间宿主福寿螺（Pomacea canaliculata）和终末宿主鼠类的分布密度及感染现状。 方法 于2015年12月-2016年9月采用分层随机抽样法分别从南澳岛抽取宫前村、金山村、六都村等3个行政村作为调查点。采集福寿螺、捕获鼠类,GPS仪记录各采样点的数据。福寿螺经形态学鉴定后,提取基因组DNA进行PCR检测复核螺种。福寿螺感染情况先用肺检法检测肺囊,再用酶消化法和匀浆法检查螺肉和肺囊。鼠类经形态学初步鉴定鼠种及性别后,再解剖采集肝脏用于PCR检测复核鼠种,剖检心、肺组织检查有无广州管圆线虫成虫感染。采集到的广州管圆线虫经形态学鉴定后,再进行PCR检测鉴定虫种。采用SAS9.3统计学软件对福寿螺、鼠类密度和感染情况进行统计分析。 结果 共采集福寿螺2 192只,随机选取1 190只用于检测,其中阳性螺72只,阳性率为6.1%。共捕获鼠类110只,包括褐家鼠（Rattus norvegicus）、黄胸鼠（R. flavipectus）、黄毛鼠（R. losea）和臭鼩（Suncus murinus）4个鼠种,其中阳性鼠32只,感染率为29.1%（32/110）,褐家鼠感染率为36.5%（31/85）,黄胸鼠有1只感染,黄毛鼠和臭鼩均为阴性;福寿螺和鼠类线粒体DNA细胞色素氧化酶Ⅰ亚基（COⅠ）扩增片段长度分别约670、706 bp,广州管圆线虫核糖体DNA内转录间隔区2（ITS2）扩增片段长度约693 bp,与预期大小相符。不同季节福寿螺密度（H = 11.603 5, P < 0.01）和感染率（χ² = 65.1 441, P < 0.01）差异均有统计学意义,不同季节鼠的密度差异也有统计学意义（H = 19.268 2, P < 0.01）;河道环境福寿螺密度最高（8.8只/m²）,但不同孶生环境下福寿螺的密度差异无统计学意义（H = 3.909 3, P > 0.05）。沟渠环境福寿螺平均感染率最高（7.5%,42/429）,且福寿螺和鼠类感染率与离居民区距离密切相关,呈现离居民区越近感染率越高的趋势。体质量大的鼠类平均感染率要高于体质量小的鼠类,不同体质量鼠类感染率差异有统计学意义（χ² = 17.530 4, P < 0.01）。 结论 广州管圆线虫重要中间宿主福寿螺和终末宿主鼠类在南澳岛分布广泛,且均存在不同程度的感染.

新疆维吾尔自治区北部地区6~12岁儿童棘球蚴病血清学调查

买买提江·吾买尔, 阿斯亚·阿西木, 王端明, 伊斯拉音·乌斯曼, 肖宁

2017, 35(3):  246-249. 

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目的 了解新疆维吾尔自治区（简称新疆）北部地区(北疆)6~12岁儿童棘球蚴病流行现状。 方法 2012年8月-2013年9月,对北疆伊犁哈萨克自治州、博尔塔拉蒙古自治州、塔城地区、阿勒泰地区、克拉玛依市、昌吉回族自治州、乌鲁木齐市、吐鲁番地区和哈密地区等9个地区（州、市）采用分层抽样的方法抽取200所小学,对6~12岁儿童采集血样,用棘球蚴IgG抗体检测试剂盒ELISA检测儿童血清抗体水平。血清抗体阳性率间的比较采用χ²检验。 结果 共检测6~12岁儿童89 006人,血清抗体阳性者1 956例,阳性率为2.20%,其中塔城地区最高,为3.91%（510/13 027）;吐鲁番地区最低,为0.56%（32/5 765）（χ² = 161.06,P < 0.05）。男性儿童阳性率为3.12%（998/47 006）,女性为2.23%（958/42 000）。12岁组阳性率最高,为2.38%（505/21 178）;10岁组最低,为2.10%（306/14 594）（χ² = 3.23,P > 0.05）,6~12岁各年龄组间差异无统计学意义（χ² = 0~3.23,P > 0.05）。在调查儿童中,哈萨克族、蒙古族、回族、汉族、维吾尔族儿童占调查总数的99.23%（88 497/89 006）,阳性率分别为3.09%（971/31 417）、2.81%（33/1 176）、1.82 %（174/9 564）、1.70%（559/32 965）和1.58%（211/13 373）,哈萨克族和蒙古族儿童阳性率高于回族、汉族和维吾尔族（χ² = 5.37~9.89,P < 0.05）。 结论 北疆6~12岁儿童棘球蚴病血清抗体阳性率仍处于一个相对较高的水平,尤其是放牧为主的哈萨克族和蒙古族儿童.

藏区肝棘球蚴病患者手术医疗费用及其相关影响因素分析

张梦媛, 伍卫平, 官亚宜, 王立英

2017, 35(3):  250-253. 

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目的 了解藏区肝棘球蚴病患者手术治疗的费用及构成,并分析其影响因素,为合理设置手术费用提供参考依据。 方法 2015年1-12月调查藏区某三甲医院住院的肝棘球蚴病手术患者。按入院先后顺序,在得到患者知情同意的情况下,采用查阅病历的方法获取患者基本资料,并了解患者的医疗费用及其各部分构成。采用Microsoft Office excel 2007建立数据库,使用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析。计算棘球蚴病患者人均医疗费用及其各部分构成,并进行敏感性分析。 结果 本次共收集49例肝棘球蚴病患者的病历资料,人均住院28.6 d。各项辅助检查次数,除磁共振检查外,均超过2次。人均医疗费用47 146.0元,多房棘球蚴病患者人均医疗费用（60 810.7元）高于细粒棘球蚴病患者（42 211.5元）（P < 0.05）,多房棘球蚴病患者的各部分费用也均高于细粒棘球蚴病患者（P < 0.05）。药品、耗材、治疗（含手术）和检查的人均费用依次为16 944.1元、12 903.0元、9 037.9元和4 823.5元,分别占35.9%、27.4%、19.2%和10.2%。手术治疗肝棘球蚴病患者的医疗费用随着住院天数的增加而升高,CT检查次数≤2次组的人均医疗费用为43 192.0元,> 2次组的人均医疗费用为53 955.7元,两者差异有统计学意义（P < 0.05）。药物费用是肝棘球蚴病患者医疗费用中最主要的敏感因素。 结论 肝棘球蚴病患者医疗费用很高,可采取合理使用药品和耗材,合理安排患者的检查次数、住院天数等措施,以降低医疗费用.

感染大片形吸虫水牛肝脏的病理变化

魏志勇, 盛兆安, 梁艺颖, 张凯, 黄维义

2017, 35(3):  254-258. 

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目的 观察沼泽型水牛感染大片形吸虫（Fasciola gigantica）囊蚴后其肝脏在不同感染阶段的病理变化。 方法 29头健康沼泽型水牛分为感染组（24）和对照组（5头）,感染组每头一次性经口感染500个大片形吸虫囊蚴,对照组不作任何处理。感染后第3、10、28、42和70天解剖水牛（感染组第42天4头,其余时间点5头;对照组各1头）,肉眼观察肝脏的病理变化;采集肝脏组织按常规方法制作组织切片,苏木素-伊红（HE）染色,光学显微镜下观察组织病理结构;Masson三色染色,光学显微镜下观察肝组织中胶原蛋白。 结果 感染组水牛在感染囊蚴后第3天,肝表面可见散在的灰白色片状病变区域,第10天灰白色片状病变更加明显并出现瘢痕,第28天肝脏表面开始出现化脓性结节,第42和70天化脓性病灶逐渐加重;对照组水牛肝表面光滑,无其他病变。肝组织切片HE染色后结果显示,感染后第3天,肝索结构轻微紊乱和肝细胞发生颗粒变性,第10天局部肝细胞核溶解、破碎,第28天肝小叶内开始出现嗜酸粒细胞浸润和肝小叶内局部出血,第42天肝小叶内大面积出血,第70天肝窦间隙内出现纤维化,肝细胞开始修复;对照组肝组织切片的肝索结构清晰,肝细胞结构正常。肝组织切片Masson三色染色结果显示,感染组水牛第42天在汇管区和肝细胞窦状隙间开始出现少量胶原纤维,第70天胶原纤维逐渐增多;对照组肝窦间隙内有少量的胶原纤维。 结论 水牛感染大片形吸虫囊蚴后,肝组织出现动态病理损伤,在感染囊蚴后第3天出现早期肝损伤,随后损伤逐步加重并呈现明显的炎性反应,至感染第42天开始出现肝纤维化的典型病理变化.

美洲钩虫蛋白酶抑制剂NaKuI1对蛋白酶的抑制作用的鉴定和特性研究

隋细香, 邵正, 蒋琦, 周叶, 何庆丰, 司徒永立, 邓莉, 彭礼飞

2017, 35(3):  259-264. 

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目的 分离美洲钩虫（Necator americanus）Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂1（NaKuI1）cDNA,并进行原核表达,研究其抑制蛋白酶的效果。 方法 根据GenBank上预测的不完整的NaKuI基因序列（XM_013449790）设计引物,运用快速扩增cDNA末端技术（SMART-RACE）分别从美洲钩虫成虫cDNA中扩增NaKuI1 cDNA的5′和3′末端序列,拼接获得全长NaKuI1 cDNA。将NaKuI1成熟肽编码基因连接入原核表达载体,构建重组质粒pET32a-sumo/NaKuI1,转化至大肠埃希菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导NaKuI1融合蛋白表达。表达产物包涵体经变性、复性、Ni-NTA亲和层析纯化后,用SUMO蛋白酶切割融合蛋白标签后获得重组蛋白rNaKuI1。用凝血时间法检测rNaKuI1的抗凝活性,发色底物法检测其对人纤溶酶、胰蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和蛋白酶3、猪胰蛋白酶和胰弹性蛋白酶及牛α-胰糜蛋白酶的抑制作用。 结果 获得NaKuI1全长cDNA,其编码的多肽由84个氨基酸残基组成,其中含16个氨基酸残基组成的信号肽,68个氨基酸残基组成的成熟肽。成熟肽原核表达产物为不可溶的包涵体。经变性、复性后纯化的rNaKuI1无抗凝血活性。在100倍摩尔浓度比下,rNaKuI1对人纤溶酶（5 nmol/L）、人胰蛋白酶（1 nmol/L）和猪胰蛋白酶（5 nmol/L）活性的抑制率近100%,对牛α-胰糜蛋白酶（1 nmol/L）和人中性粒细胞弹性蛋白酶（5 nmol/L）活性的抑制率分别约31.45%和25.18%,对人组织蛋白酶G、蛋白酶3和猪胰弹性蛋白酶均无抑制作用。rNaKuI1抑制人胰蛋白酶及纤溶酶的抑制常数（ki）分别为（21.17 ± 7.22）和（21.72 ± 3.95）nmol/L。 结论 成功分离获得NaKuI1全长cDNA序列,其原核表达产物rNaKuI1具有较强抑制胰蛋白酶和纤溶酶活性的特点.

Toll样受体4诱导感染微小隐孢子虫的小鼠树突状细胞功能的体外研究

方芬, 刘喆, 王桂军, 徐前明

2017, 35(3):  265-269. 

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目的 体外分析Toll样受体（TLR）4诱导感染微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）小鼠的树突状细胞（DC）功能。 方法 纯化脱囊隐孢子虫经5(6)-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯标记隐孢子虫子孢子,PCR鉴定隐孢子虫种。制备小鼠骨髓源树突状细胞,培养至第7天,于培养板各孔中分别加入1 ml DC,TLR4抗体组加入1 ml脱囊标记的隐孢子虫子孢子（2 × 10⁵/孔）和0.5 ml TLR4抗体（终浓度为1 μg/ml）,感染组加入脱囊标记的隐孢子虫子孢子1 ml和0.5 ml RPMI 1640培养基,空白对照组加入1.5 ml RPMI 1640培养基。每组各3孔。培养2 h后,流式细胞术检测各组的CD11c⁺相对表达水平,Flowjo软件比较各组树突状细胞的成熟情况。感染后24 h,荧光显微镜观察各组隐孢子虫子孢子与树突状细胞的黏附情况。各组CD11c⁺相对表达水平间的差异采用χ²检验。 结果 纯化后的隐孢子虫经PCR扩增,获得长度为830 bp的条带,鉴定为微小隐孢子虫。流式细胞术检测结果显示,TLR4抗体组和感染组的树突状细胞CD11c⁺相对表达水平分别为67.67 ± 1.80和83.37 ± 3.73,与空白对照组（7.06 ± 0.02）比较,差异均有统计学意义（P < 0.05）;TLR4抗体组与感染组间差异也有统计学意义（P < 0.05）。Flowjo软件分析结果显示,TLR4抗体组的CD11c⁺相对表达水平的峰值低于感染组,表明TLR4抗体组DC的成熟度低于感染组。荧光显微镜观察发现,TLR4组和感染组的隐孢子虫子孢子均可与树突状细胞发生黏附现象。 结论 TLR4可诱导感染隐孢子虫小鼠的DC成熟.

猬迭宫绦虫裂头蚴感染小鼠皮下肌肉组织β1转化生长因子含量变化的观察

张勇, 李金福, 陈艳, 蔡倩彤

2017, 35(3):  270-274. 

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目的 探讨β1转化生长因子（TGF-β1）在猬迭宫绦虫（Spirometra erinacei）裂头蚴感染小鼠皮下肌肉组中的表达情况及意义。 方法 对采自野生王锦蛇（Elaphe carinata）的裂头蚴进行形态学观察和PCR检测。昆明小鼠80只,用数字随机表法挑选40只,雌雄各半作为实验组,剩余40只为对照组。用蛇源裂头蚴经口喂饲实验组小鼠,5条/鼠。于喂饲后第7、14、28、56天各随机剖杀10只,分别收集含有裂头蚴寄生的皮下肌肉组织,用中性甲醛固定,制作石蜡切片。HE染色后,观察裂头蚴感染病灶周围的病理变化和纤维化程度;免疫组化检测皮下肌肉中TGF-β1的含量变化。对照组不喂饲裂头蚴,检测时间及方法同实验组。 结果 PCR扩增获得约400 bp的目的条带。测序结果显示,该裂头蚴COX1基因与GenBank中的猬迭宫绦虫序列一致性为99.12%。HE染色检查,皮下肌肉中的裂头蚴被炎性囊壁所包裹,虫体与囊壁之间形成穴腔,穴腔有时出现少许的浆液或血液。囊壁最里面的区域有薄层的纤维蛋白、坏死的碎片,壁中早期以中性粒细胞浸润为主,也有嗜酸粒细胞、巨噬细胞、浆细胞等,随着病程的进展,炎性囊壁逐渐扩大,壁中以慢性炎性细胞浸润为主,囊壁周围是宿主的组织细胞,纤维结缔组织增生明显,并有不同程度的纤维化。免疫组化检查结果显示,TGF-β1的主要表达部位为裂头蚴周围的炎症反应带和纤维结缔组织增生部位。TGF-β1相对表达量在感染后逐渐增高,于感染第28天达峰值（0.654 5 ± 0.045 5）,第56天时明显下降。在感染后第7~56天,实验组的TGF-β1水平为（0.502 6 ± 0.008 2）~（0.346 8 ± 0.030 4）与同期对照组的（0.270 0 ± 0.001 6）~（0.274 0 ± 0.005 1）比较,差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 小鼠感染猬迭宫绦虫裂头蚴早、中期,TGF-β1表达水平均提高,其免疫抑制作用不利于清除和控制皮下肌肉组织中的裂头蚴.

棕尾别麻蝇蛹3个发育时期的转录组差异分析

周昊, 王启燕, 张红玲, 任峥, 戴佳琳, 刘玉波, 王杰, 黄江

2017, 35(3):  274-279. 

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目的 探讨棕尾别麻蝇（Boettcherisca peregrine）蛹3个时期转录组的差异表达,为进一步探究棕尾别麻蝇蛹各个时期转录组变化提供实验数据。 方法 提取棕尾别麻蝇蛹3个时期第1（MY1）、5（MY2）和10天（MY3）的蝇蛹总RNA,反转录成cDNA,并进行测序,使用软件edgeR对基因差异表达进行分析,对差异基因进行GO分类统计和富集分析;对已被注释的基因单基因簇（Unigene）进行KEGG代谢通路分析;使用MISA对Unigene进行简单重复序列（SSR）检测。 结果 蝇蛹3个时期cDNA经基因差异表达分析,得到各时期样品基因组表达水平,共捕获38 727条Unigenes,将不同时期的蝇蛹转录组进行两两比较,其差异表达基因数介于1 263~2 430,差异基因总数为5 283。聚类图型得到MY1、MY2和MY3组的两个样品表达模式相似,聚为一支。棕尾别麻蝇蛹转录组共有8 856个Unigenes被注释,被注释到的代谢通路有336个。SSR查找发现,从8 645个Unigenes中共查找到12 146个SSR位点,占Unigene总数的22.3%。其中,单核苷酸重复所占比例最高,达到69.2%,其次是三核苷酸重复（21.0%）。SSR不同重复基元类型中,出现频率最高的为A/T,其次是AAC/GTT、AG/GT。 结论 棕尾别麻蝇蛹在不同时期基因表达有显著差异.

我国部分地区28种蚊虫的线粒体COⅠ基因序列分析

郭玉燕, 罗雷, 宋璋瑶, 郑学礼

2017, 35(3):  280-287. 

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目的 分析我国部分地区28种蚊虫的线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ（mitochondrion cytochrome c oxidase subunit Ⅰ,COⅠ）基因序列,探讨其作为蚊虫分子标记的应用潜力。 方法 2015年3月至2016年10月在我国海南、广东、广西、云南、福建、浙江、河南、山西、天津、内蒙古、吉林和黑龙江等12省（自治区、直辖市）的蚊虫孳生地采集幼虫,室内饲养至羽化成蚊,在蚊虫栖息地和蚊虫监测点,采用灯诱法和人诱法采集成蚊。所有成蚊经形态学鉴定后,提取单只蚊虫基因组DNA,采用国际双翅目通用引物PCR扩增并克隆线粒体COⅠ基因5′端片段,并进行测序。所得COⅠ基因序列上传GenBank获取登录号。序列通过Clustal1.83和MEGA5.05软件进行多序列比对,用DNAMAN9.0软件分析同源性。采用Mega5.05软件进行序列特征分析、计算遗传距离。每种蚊虫随机选择1~4条线粒体COⅠ基因序列,采用邻接法（NJ）构建系统发育进化树。 结果 共采集3亚科6属28种301只蚊虫,分别为伊蚊属（Aedes）的白纹伊蚊（Ae. albopictus）等5种、按蚊属（Anopheles）的中华按蚊（An. sinensis）等6种（亚种）、库蚊属（Culex）的二带喙库蚊（Cx. bitaeniorhynchus）等14种（亚种）、阿蚊属（Armigeres）的骚扰阿蚊（Ar. subalbatus）、曼蚊属（Mansonia）的常型曼蚊（Ma. uniformis）和巨蚊属（Toxorhynchites）的华丽巨蚊（Tx. splendens）。PCR扩增结果显示,28种蚊虫线粒体COⅠ基因的长度约711 bp,经多序列比对排齐后长度为651 bp。不同种别蚊虫的线粒体COⅠ序列同源性范围为97.85%~99.97%。种内K2P遗传距离为0.15%~2.89%,属内种间遗传距离为0.25%~14.50%。其中,按蚊属6种蚊虫COⅠ序列存在153个变异位点,131个简约信息位点,T + A平均含量为67.70%;编码的217个氨基酸残基中保守氨基酸206个（占94.9%）;6种蚊虫的核苷酸同源性为98.31%~99.72%,种内K2P遗传距离为0.41%~1.56%,种间K2P遗传距离为1.07%~14.50%。28种蚊虫（60条）COⅠ序列的系统发育树分析结果显示,种团内近缘种（尖音库蚊、淡色库蚊和致倦库蚊）聚在一起,但近缘种之间未完全隔开;白跗按蚊（An. albitarsis）和迷走按蚊（An. vagus）聚在一起,其余23种蚊虫分别以种为单位聚在一起。 结论 基于线粒体COⅠ基因的分子标记可以区分捕获蚊虫的部分蚊种,但尚未能有效及准确地区分近缘种.

综述

弓形虫非复制型尿嘧啶营养缺陷型疫苗株对肿瘤的免疫治疗作用

吴一凡, 吕芳丽

2017, 35(3):  288-293. 

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【提要】 刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种单细胞寄生原虫, 入侵机体后可诱导机体产生抗弓形虫免疫应答, 这种免疫应答与抗肿瘤免疫应答有相似之处。近年的研究发现, 弓形虫非复制型尿嘧啶营养缺陷型疫苗株（nonreplicating avirulent uracil auxotroph vaccine strain, cps）能有效地抑制多种实体瘤的进展。本文就弓形虫cps株对小鼠卵巢癌、胰腺癌和黑色素瘤的免疫治疗进展进行综述, 以期为个体化癌症免疫治疗提供有价值的参考。

长链非编码RNA在寄生虫中的研究进展

于爱萍, 沈玉娟

2017, 35(3):  294-299. 

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【提要】 长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）是一类转录本长度大于200 nt,缺乏蛋白质编码功能的RNA分子。LncRNA在多种生物学进程中发挥重要的调节功能,广泛参与细胞增殖、分化、代谢、凋亡等重要的生理活动。LncRNA在寄生虫发育、代谢、生理和致病机制中也发挥重要作用。本文就lncRNA在寄生虫学研究中的进展作一综述。

CRISPR/Cas9系统在寄生虫领域的研究进展

付益修, 孔庆明, 陆绍红

2017, 35(3):  299-304. 

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【提要】 CRISPR/Cas9是一种有效的基因组靶向修饰系统,能够实现对基因组特定位点的基因敲除、定点插入和基因修复等遗传操作,为寄生虫的基因功能分析、药物靶点和疫苗分子筛选等研究提供了技术创新平台。本文对CRISPR/Cas9系统的原理及其在刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）、疟原虫（Plasmodium）、锥虫（Trypanosoma）和利什曼原虫（Leishmania）等重要寄生虫研究中的新进展进行综述,分析讨论现阶段该系统在寄生虫研究应用方面存在的问题和优化策略。

蚊虫共生微生物群多样性及功能的研究进展

王晓明, 吴焜, 陈晓光, 闫桂云

2017, 35(3):  305-312. 

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蚊虫共生微生物群对蚊虫的生长、发育、繁殖及媒介效能具有很大的作用及影响。本文从蚊虫微生物群的组成、多样性和影响因素,以及微生物群对蚊虫的影响及常见功能等方面进行综述。

信息交流

中国9省（自治区）级寄生虫病预防控制机构人才队伍现状分析

蒉嫣, 曹淳力, 田申, 薛靖波, 武佳妮, 诸一凤, 李石柱, 周晓农

2017, 35(3):  313-317. 

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目的 了解我国省级寄生虫病预防控制机构人员状况,为相关部门合理配置寄生虫病预防控制机构人员提供科学依据。 方法 2016年3-6月选取我国东部（安徽、山东、江苏）,中部（江西、河南、广东）和西部（新疆、四川、云南）等9个省（自治区）的省级寄生虫病预防控制机构,通过问卷调查方式进行横断面调查,发放机构和职工两类自填式问卷,内容涉及人员总量、年龄、职称级别、收入满意度等。数据采用SAS 9.3软件进行统计学分析。 结果 9省（自治区）级寄生虫病预防控制机构现有工作人员528名,平均年龄42岁,其中45岁及以下人员比例为55.9%（295/528）,大学本科及以上学历人员比例为76.5%（404/528）,高级职称人员比例为31.4%（166/528）;收入水平和职称晋升机制满意度得分分别为 2.42/5、2.86/5。 结论 9省（自治区）级寄生虫病预防控制机构队伍以中青年、高学历人才为主,中级及以上职称人员所占比例较大,而职工对收入和晋升机制的满意度较低.