谢自新1，姜洁2，汪文寰3，吕金辉2，冯方方2，张丽芳2，李文姝2*
XIE Zi-xin1, JIANG Jie2, WANG Wen-huan3, LV Jin-hui2, FENG Fang-fang2, #br# ZHANG Li-fang2, LI Wen-shu2*
摘要：
目的 构建弓形虫复合抗原ROP2-SAG1免疫优势表位（RSepitope）与人乳头瘤病毒16型晚期结构蛋白L1（HPV16L1）的融合体（RSepitope-HPV16L1），验证其在真核细胞中的表达。 方法 优化RSepitope基因序列，构建pcDNA3.1/RSepitope重组真核表达质粒。从T-HPV16L1质粒中扩增HPV16L1基因片段，构建pcDNA3.1/RSepitope-HPV16L1重组质粒。双酶切、PCR、测序鉴定正确后，将2个重组质粒分别转染至非洲绿猴肾细胞COS-7细胞，培养48 h后收集细胞，提取RNA，RT-PCR扩增相应的目的基因。Western blotting和间接免疫荧光实验检测重组蛋白RSepitope和RSepitope-HPV16L1在细胞中的表达。 结果 构建的重组质粒pcDNA3.1/RSepitope和pcDNA3.1/RSepitope-HPV16L1经PCR扩增和双酶切分别获得282 bp和1 500 bp片段，与预期结果一致，测序结果正确。RT-PCR结果显示，以2个重组质粒转染细胞的cDNA为模板，分别扩增到282 bp和1 500 bp的目的条带。Western blotting分析结果显示，以RSepitope免疫血清为一抗，重组蛋白RSepitope和RSepitope-HPV16L1分别在相对分子质量（Mr）约为10 000和65 000处出现特异性条带；以HPV16L1单克隆抗体为一抗，重组蛋白RSepitope-HPV16L1在Mr 65 000处出现特异性条带。间接免疫荧光实验结果显示，以RSepitope免疫血清为一抗，重组质粒pcDNA3.1/RSepitope和pcDNA3.1/RSepitope-HPV16L1转染细胞内均观察到绿色荧光；以HPV16L1单克隆抗体为一抗，重组质粒pcDNA3.1/RSepitope-HPV16L1转染细胞内观察到特异性绿色荧光。 结论 弓形虫优势表位RSepitope与HPV16L1融合体构建成功，且可在真核细胞中表达。
