刚地弓形虫表面抗原1、2 B细胞表位基因的融合表达和鉴定

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ›› 2017, Vol. 35 ›› Issue (6): 575-579.

刚地弓形虫表面抗原1、2 B细胞表位基因的融合表达和鉴定

王钊哲¹, 许瑞¹, 洪炀¹, 林矫矫^1,², 陆珂¹, 李浩¹, 陈兆国¹, 石耀军¹, 吴思敏¹, 江嘉欣¹, 李嘉静¹, 朱传刚^1,^*()

1 中国农业科学院上海兽医研究所,农业部寄生虫学重点开放实验室,国家防治动物血吸虫病专业实验室,上海 200241
2 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,扬州 225009

收稿日期:2017-03-20 出版日期:2017-12-30 发布日期:2018-01-10
通讯作者: 朱传刚
基金资助:
中央级公益性科研院所基本科研业务费（No.2017JB20）

Fusion expression and identification of B cell epitopes of Toxoplasma gondii surface antigens（SAG）1 and 2

Zhao-zhe WANG¹, Rui XU¹, Yang HONG¹, Jiao-jiao LIN^1,², Ke LU¹, Hao LI¹, Zhao-guo CHEN¹, Yao-jun SHI¹, Si-min WU¹, Jia-xin JIANG¹, Jia-jing LI¹, Chuan-gang ZHU^1,^*()

1 Natural Laboratory of Animal Schistosomiasis Control, Key Laboratory for Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 200241, China
2 Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China

Received:2017-03-20 Online:2017-12-30 Published:2018-01-10
Contact: Chuan-gang ZHU

摘要/Abstract

摘要：

目的构建刚地弓形虫（以下简称弓形虫）表面抗原（SAG）1、2 B细胞表位基因片段的原核表达系统,并对其免疫反应性进行分析。方法根据GenBank中已公布的编码弓形虫表面抗原的SAG基因序列,分析SAG1和SAG2基因的B细胞表位,设计并合成弓形虫表面抗原SAG1和SAG2蛋白的B细胞表位基因,将目的基因与pET-28a(+)表达质粒连接,并转化至大肠埃希菌（Escherichia coli）BL21（DE3）感受态细胞中,挑取完整单个菌落于含卡那霉素的LB液体培养基中,菌液进行PCR扩增、双酶切和测序鉴定;菌液振荡培养至吸光度（A₄₅₀值）为0.6~0.8时,加入终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,得到带有His标签的融合蛋白,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE））电泳,对蛋白的可溶性进行分析。使用His亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化,将带有His标签的纯化重组蛋白进行蛋白质印迹（Western blotting）分析和ELISA分析免疫反应性。结果构建的pET28a(+)-SAG重组质粒,菌液经PCR、双酶切鉴定结果显示,在909 bp处出现特异性目的条带,与预期相符,经测序表明重组表达质粒构建成功。SDS-PAGE鉴定结果显示,重组蛋白rSAG相对分子质量（M_r）约50 000,为可溶性表达,与预期结果相符。Western blotting分析结果显示,重组蛋白可以与弓形虫感染小鼠阳性血清1 ∶ 100发生特异性结合。ELISA检测结果显示,重组蛋白稀释度为1 ∶ 1,阳性血清稀释度为1 ∶ 50时,阳性反应最明显,A₄₅₀值为1.037 9。不同稀释倍数的重组蛋白rSAG与不同浓度的小鼠弓形虫阳性血清均可发生反应,并能很好的区分阴性和阳性血清。结论构建了弓形虫表面抗原SAG1和SAG2蛋白的B细胞表位基因的原核表达系统,重组蛋白rSAG为可溶性表达,并具有较好的免疫反应性。

关键词: 刚地弓形虫, 抗原表位, 重组序列, 免疫反应性

Abstract:

Objective To construct the prokaryotic expression system for B cell epitopes of Toxoplasma gondii surface antigens（SAG）1 and 2, and analyze their immunoreactivity.Methods The B cell epitope sequences of Toxoplasma gondii SAG1 and SAG2 were designed and synthesized according to the gene sequences of SAG1 and SAG2 published in GenBank.The target gene was subcloned into pET-28a(+), and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3).Complete single colonies were then selected from LB medium containing kanamycin.After culture under shaking to an absorbance(A₄₅₀) value of 0.6-0.8, IPTG was added at a final concentration of 1 mmol/L to induce expression of the target gene.To obtain high concentrations of recombinant SAG(rSAG), the rSAG protein was purified using a His fusion protein purfication kit, and the resultant His-tagged purified protein was identified by Western blotting and ELISA.Results of PCR and double-enzyme digestion showed a specific protein band at ~909 bp.As expected, sequencing of the band further confirmed the construction of rSAG.SDS-PAGE revealed the rSAG molecular weight(M_r) of ~50 000.Western blotting showed specific binding of rSAG with a 1 ∶ 100 dilution of T.gondii-positive mouse serum.ELISA results showed a most positive reaction with the dilution of 1 ∶ 1 for recombinant protein and the dilution of 1 ∶ 50 for positive serum.Moreover, reactions between different dilutions of rSAG and different concentrations of T.gondii-positive mouse serum, and a good performance in distinguishing negative from positive serum.Conclusion The constructed recombinant protein rSAG is soluble and has good immunoreactivity.

Key words: Toxoplasma gondii, Antigen epitopes, Recombination sequence, Immune reactivity

中图分类号:

R382.5

王钊哲, 许瑞, 洪炀, 林矫矫, 陆珂, 李浩, 陈兆国, 石耀军, 吴思敏, 江嘉欣, 李嘉静, 朱传刚. 刚地弓形虫表面抗原1、2 B细胞表位基因的融合表达和鉴定[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2017, 35(6): 575-579.

Zhao-zhe WANG, Rui XU, Yang HONG, Jiao-jiao LIN, Ke LU, Hao LI, Zhao-guo CHEN, Yao-jun SHI, Si-min WU, Jia-xin JIANG, Jia-jing LI, Chuan-gang ZHU. Fusion expression and identification of B cell epitopes of Toxoplasma gondii surface antigens（SAG）1 and 2[J]. Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases, 2017, 35(6): 575-579.

图/表 5

图1

图2

图3

图4

表1

参考文献 13

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血清稀释度Serum dilution		重组蛋白不同稀释度（/10 μg·ml^-1）的A₄₅₀值 Recombinant protein dilution （/10 μg·ml^-1）A₄₅₀
血清稀释度Serum dilution		1 ∶ 1	1 ∶ 2	1 ∶ 4	1 ∶ 8
弓形虫阳性血清Toxoplasma-positive serum	1 ∶ 50	1.037 9	0.809 8^a	0.716 4^a	0.639 7^a
	1 ∶ 100	0.857 6^b	0.730 6^ab	0.608 0^ab	0.514 4^ab
	1 ∶ 200	0.757 0^b	0.692 6^ab	0.574 6^ab	0.476 2^ab
	1 ∶ 400	0.719 8^b	0.682 6^ab	0.554 6^ab	0.472 4^ab
	1 ∶ 800	0.701 8^b	0.673 1^ab	0.554 4^ab	0.472 1^ab
阴性血清Negative serum	1 ∶ 50	0.074 7	0.082 3	0.085 7	0.070 6
	1 ∶ 100	0.082 0	0.073 3	0.080 5	0.087 3
	1 ∶ 200	0.078 9	0.097 3	0.083 0	0.072 9
	1 ∶ 400	0.096 2	0.089 4	0.091 5	0.092 7
	1 ∶ 800	0.086 2	0.080 0	0.083 4	0.083 9

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