徐前明1,2*,袁恒青1,赵长城1,方芬1,刘喆1,宁红蕊1,2,石大丽1,李郁1,王海洋1
XU Qian-ming1,2*, YUAN Heng-qing1, ZHAO Chang-cheng1, FANG Fen1, LIU Zhe1, NING Hong-rui1,2, SHI Da-li1, LI Yu1, WANG Hai-yang1
摘要: 目的 建立高效检测刚地弓形虫(Toxoplama gondii)的环介导等温扩增(LAMP)方法,为弓形虫病诊断提供新的技术手段。 方法 采用在线引物设计软件Primer Explorer 4.0设计弓形虫529 bp基因LAMP扩增引物,用已构建的pMD-19T-529 bp重组质粒为模板,建立LAMP扩增反应,通过添加环引物、设置不同浓度的甜菜碱和MgSO4以及不同反应温度对扩增反应体系和反应条件进行优化。以猪、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、猪等孢球虫(Isospora suis)的基因组DNA和超纯水为对照,pMD-19T-529 bp重组质粒为模板,分别进行优化后的LAMP和PCR扩增,评价LAMP方法的特异性。将pMD-19T-529 bp重组质粒梯度稀释为109~100 copies/ml,分别进行优化后的LAMP和PCR扩增,评价LAMP方法的灵敏性。 结果 设计的LAMP扩增引物可扩增出弓形虫529 bp序列保守区域的目的片段。优化结果显示,最佳反应总体系为25 μl,其中,甜菜碱最佳浓度为0.4 mol/L,MgSO4最佳浓度为6 mmol/L;添加环引物反应30 min的扩增效率与未添加环引物反应60 min的扩增效率相当,可使反应时间缩短30 min;最佳反应条件为63 ℃ 30 min,80 ℃ 3 min。特异性检测结果显示,所建立的LAMP方法可特异扩增弓形虫529 bp基因片段, 对照均未扩增出目的片段。灵敏性检测结果显示,LAMP方法的最低检出值达103 copies/ml,效率为PCR扩增(104 copies/ml)的10倍。 结论 建立了弓形虫529 bp重复序列的LAMP检测方法,该法具有较好的特异性和灵敏性。