中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ›› 2013, Vol. 31 ›› Issue (5): 5-352-356.
李润花1,2,郝海霞2,王海龙2,孟晓丽2,申金雁2,殷国荣2 *
LI Run-hua1,2, HAO Hai-xia2, WANG Hai-long2, MENG Xiao-li2, SHEN Jin-yan2, YIN Guo-rong2 *
摘要: 目的 克隆和表达刚地弓形虫肌动蛋白(TgACT)基因,并分析其免疫反应性。 方法 提取弓形虫RH株速殖子的总RNA。根据TgACT基因编码序列(登录号为XM_002369622.1)设计合成引物,进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增,扩增产物经双酶切后连接入pET-30a(+)载体。将重组质粒pET30a-TgACT转化至大肠埃希菌(E. coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。pET30a-TgACT在E. coli BL21(DE3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定。分别用抗多聚组氨酸标签(Anti-His)抗体和兔抗弓形虫血清为一抗进行蛋白质印迹(Western blotting)分析。 结果 RT-PCR扩增产物约为1 100 bp。菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒pET30a-TgACT构建成功。SDS-PAGE结果表明,目的蛋白在E. coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达,相对分子质量(Mr)约为49 000。通过蛋白的变性和复性处理及纯化,获得可溶性纯化蛋白。Western blotting结果显示,重组TgACT蛋白能被Anti-His抗体和兔抗弓形虫血清识别。 结论 成功构建重组质粒pET30a-TgACT,获得刚地弓形虫重组肌动蛋白,且具有免疫反应性。