中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ›› 2018, Vol. 36 ›› Issue (5): 464-468.
吴尚桦, 耿娥燕, 张静, 张衡, 施之强, 汪汕, 陆维, 吴以振, 王桂军, 王勇, 徐前明*()
Shang-hua WU, E-yan GENG, Jing ZHANG, Heng ZHANG, Zhi-qiang SHI, Shan WANG, Wei LU, Yi-zhen WU, Gui-jun WANG, Yong WANG, Qian-ming XU*()
摘要:
目的 探讨自噬相关5(ATG5)蛋白对刚地弓形虫(简称弓形虫)体外刺激树突状细胞(DCs)成熟的影响。方法 采用TRIzol法提取昆明小鼠总RNA,反转录为cDNA,经PCR扩增获得ATG5基因。构建重组质粒pET-32a-ATG5,转入大肠埃希菌Rosetta株中表达,尿素纯化后用抗His标签单抗蛋白质印迹(Western blotting)鉴定ATG5。分离鼠源DCs,用弓形虫体外感染DCs。感染实验分为3组:对照组(仅含DCs)、弓形虫组(弓形虫 + DCs)和ATG5蛋白组(ATG5蛋白 + 弓形虫 + DCs),每组设3次重复,各组弓形虫速殖子(1 × 104个)同时加入到DCs中,37 ℃、5% CO2共培养2 h。其中,ATG5蛋白组弓形虫在感染DCs前,预先与ATG5蛋白(50 μg)在体外作用2 h。采用流式细胞术检测CD11cCD83双表达成熟型DCs在细胞总数中比例的变化,分析DCs的成熟情况,评价ATG5蛋白对弓形虫体外刺激DCs成熟的影响。结果 ATG5扩增产物约为729 bp,ATG5蛋白相对分子质量(Mr)约为46 000。Western blotting检测结果显示,重组ATG5蛋白具有良好的反应原性。流式细胞术结果显示,对照组、弓形虫组、ATG5蛋白组中CD11cCD83双表达成熟型DCs在细胞总数的比例分别为(13.3 ± 0.5)%、(52.5 ± 0.3)%和(47.8 ± 0.6)%,弓形虫组和ATG5蛋白组差异有统计学意义(P < 0.01),对照组与其他两组的差异有统计学意义(P < 0.01)。结论 ATG5蛋白可降低弓形虫体外刺激DCs成熟的能力。
中图分类号: