• 论著 • 下一篇
郭玲玲，张晓磊，张进顺*，贾晓晖，王春苗，姜文静，朱晓波，贾天军
GUO Ling-ling, ZHANG Xiao-lei, ZHANG Jin-shun*, JIA Xiao-hui, WANG Chun-miao，
摘要：
【摘要】 目的 构建刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）棒状体蛋白18（ROP18）与ROP12的复合基因真核表达重组质粒，并检验其在真核细胞中的表达情况。 方法 重组质粒pVAX1-ROP18和pVAX1-ROP12分别经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切，将ROP12基因克隆至pVAX1-ROP18重组质粒。经菌落PCR、酶切及测序鉴定正确的重组表达质粒pVAX1-ROP18-ROP12转染至HeLa细胞。同时设空质粒组、pVAX1-ROP18转染组和pVAX1-ROP12转染组。提取各组HeLa细胞的总RNA并逆转录为cDNA，分别进行管家基因β-肌动蛋白和ROP18-ROP12复合基因的RT-PCR鉴定；同时，采用间接荧光免疫法和蛋白质印迹（Western blotting）法检测重组质粒pVAX1-ROP18-ROP12瞬时转染HeLa细胞后蛋白的表达情况。 结果 重组质粒pVAX1-ROP18-ROP12的菌落PCR电泳显示在约2 373 bp处出现特异性扩增片段，与预期大小相符。提取重组质粒经HindⅢ、BamHⅠ和XbaⅠ单酶切、双酶切及三酶切鉴定均正确。测序结果显示，pVAX1-ROP18-ROP12重组质粒与已发表的弓形虫RH株ROP18基因（登录号为AM075204.1）序列一致性为100%，与弓形虫RH株ROP12基因（登录号为DQ096559.1）序列一致性为99%。脂质体转染后各组β-肌动蛋白的RT-PCR扩增产物均为613 bp，与预期大小相符。pVAX1-ROP18-ROP12转染组的ROP18-ROP12复合基因扩增产物大小为2 373 bp，而其他组未见条带。间接荧光法检测显示，在重组质粒转染的HeLa细胞胞浆中观察到黄绿色荧光，而对照组无黄绿色荧光。Western blotting法检测显示，融合蛋白ROP18-ROP12相对分子质量（Mr）约为85 000。 结论 构建了重组质粒pVAX1-ROP18-ROP12，该质粒能在真核细胞中表达。
