中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ›› 2014, Vol. 32 ›› Issue (1): 5-24-28.
殷丽天1，祝建疆2，李润花3，王海龙2，李雅清2，殷国荣2 *
YIN Li-tian1，ZHU Jian-jiang2，LI Run-hua3，WANG Hai-long2，LI Ya-qing2，YIN Guo-rong2 *
摘要： 【摘要】 目的 预测刚地弓形虫尿苷磷酸化酶（uridine phosphorylase，TgUPase）基因编码蛋白的主要特性和抗原表位，克隆、表达TgUPase基因，并检测其免疫反应性。 方法 采用生物信息学在线分析程序和软件预测TgUPase蛋白的理化性质和抗原表位。提取RH株弓形虫速殖子总RNA。根据TgUPase基因全长编码序列（GenBank登录号为DQ385446.1）的开放阅读框设计引物，并用RT-PCR扩增，扩增产物经双酶切后连接入pET-30a（+）载体。用重组质粒转化大肠埃希菌（E. coli）DH5α，阳性菌落经PCR、双酶切和测序鉴定。将重组质粒pET-30a（+）-TgUPase转化至E. coli BL21（DE3），并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结合考马斯亮蓝染色检测表达产物，分别以抗His标签抗体和人抗弓形虫血清为一抗，蛋白质印迹（Western blotting）分析重组蛋白及其免疫反应性。 结果 生物信息学预测结果显示，TgUPase蛋白由303个氨基酸组成，相对分子质量（Mr）为33 042.9，为可溶性蛋白，有3个潜在的T/B细胞联合抗原表位。RT-PCR扩增产物约为921 bp。菌落PCR、双酶切以及测序结果表明，重组质粒pET-30a（+）-TgUPase构建成功。SDS-PAGE结果表明，经IPTG诱导获得约Mr 38 000的可溶性重组蛋白（带His标签）。Western blotting结果显示，重组蛋白能被His标签抗体和人抗弓形虫血清识别。 结论 成功构建了重组质粒pET-30a（+）-TgUPase，获得刚地弓形虫重组尿苷磷酸化酶，且重组蛋白具有免疫反应性。
