鼠尿液中弓形虫B1基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ›› 2010, Vol. 28 ›› Issue (5): 16-338.

鼠尿液中弓形虫B1基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

骆方军¹，姚洪锋¹，王永明¹，谭峰^{2 *}

1 浙江省诸暨市人民医院检验科，诸暨 311800； 2 温州医学院寄生虫学教研室，温州 325035

收稿日期:1900-01-01 修回日期:1900-01-01 出版日期:2010-10-30 发布日期:2010-11-09
通讯作者: 谭峰

Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction detection for Toxoplasma gondii B1 gene in mice urine

LUO Fang-jun¹，YAO Hong-feng¹，WANG Yong-ming¹，TAN Feng^{2 *}

1 Department of Clinical laboratory, Zhuji People′s Hospital, Zhuji 311800, China；2 Wenzhou Medical College, Wenzhou 325035, China

Received:1900-01-01 Revised:1900-01-01 Online:2010-10-30 Published:2010-11-09
Contact: TAN Feng

摘要/Abstract

摘要： 根据GenBank中弓形虫B1基因序列，设计1对引物和1条TaqMan探针。从感染弓形虫小鼠尿液提取弓形虫总DNA，先用普通PCR扩增获得目的基因产物，将纯化的回收产物与pMD18-T载体连接，测序证实为目的片段后，制备系列浓度参照品。再优化实时荧光定量PCR反应体系，并对体系的灵敏度、重复性、线性、特异性和参照品稳定性进行评价。其灵敏度为10⁴拷贝/ml；批内变异系数为2.42%，批间变异系数为4.18%，线性为10³～10⁷拷贝/ml，特异性为100%，参照品稳定。该法检测鼠尿样弓形虫DNA具有方便、灵敏、特异和重复性好等优点。

关键词: 小鼠, 尿液, 刚地弓形虫, 实时荧光定量聚合酶链反应

Abstract: A pair of specific primers and a TaqMan probe were designed based on the sequence of Toxoplasma gondii B1 gene from GenBank database. Total DNA of T. gondii was extracted from fresh mice urine. DNA fragment of B1 gene was amplified by PCR. The PCR product was cloned into pMD18-T vector. Following identification, the positive recombinant plasmid was used as reference template to generate standard curve and melt curve. Sensitivity, reproducibility, linear range and stability of reference plasmids were determined. The sensitivity of this method was 10⁴ copies/ml. The coefficient of variation （cv） of intra-assay and inter-assay were 2.42% and 4.18%, respectively. Linear range was （10³-10⁷） copies/ml. The specificity was 100%. The reference materials were stable. Real-time FQ-PCR of T. gondii DNA in mice urine has been constructed, which is a convenient, sensitive and reliable method for quantifying T. gondii DNA in mice urine.

Key words: Mouse, Urine, Toxoplasma gondii, Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction

骆方军;姚洪锋;王永明;谭峰. 鼠尿液中弓形虫B1基因实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2010, 28(5): 16-338.

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