中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ›› 2007, Vol. 25 ›› Issue (1): 1-5.
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李树玲;张冬梅;曹毅;潘卫庆
LI Shu-ling;ZHANG Dong-mei;CAO Yi;PAN Wei-qing
摘要： 目的 表达伯氏疟原虫顶端膜抗原1（PbAMA-1）胞外区E及其各亚区，分析其免疫原性和免疫保护作用。 方法 抽提伯氏疟原虫基因组，对PbAMA-1基因测序，依据该序列采用毕赤酵母密码子使用频率重新设计PbA-MA-1基因序列。将其胞外区E分为3个彼此重叠的基因片段DⅠ、DⅡ和 DⅢ并进行优化，人工合成后在大肠埃希菌中诱导表达。表达产物经纯化和重折叠，分别与福氏佐剂乳化后免疫小鼠和家兔, 均免疫3次， 间隔2周。每次免疫剂量, 小鼠为20μg, 家兔为100 μg。ELISA检测抗体效价，并以疟原虫攻击实验确定各抗原的免疫保护效果。 结果 测得的PbAMA-1基因序列与Sanger测序中心公布的序列完全一致。密码子优化并人工合成的DⅠ、DⅡ、DⅢ 和E目的基因片段在大肠埃希菌表达载体pET32a均获得诱导表达，经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，各目的基因表达产物大小与预计的相对分子质量Mr 44 300、Mr 33 300、Mr 29 900和Mr 67 200相一致。表达产物经镍离子螯合柱（Ni-NTA柱）纯化和谷胱甘肽(GSH)氧化还原法体外重折叠，蛋白纯度达90%以上, 各纯化的重组蛋白在小鼠体内均激发产生高滴度抗体。其中，完整的胞外区E第3次免疫后抗体滴度为（34.4±0.15）×10-4，与其他组相比，免疫原性较其他各亚区更强(t=5.66，P<0.01；t=2.27，P<0.05和t=5.05，P<0.01)。取家兔免疫血清与感染伯氏疟原虫ANKA株的小鼠血膜抗原片进行间接荧光抗体试验(IFAT)，均为阳性，其中抗E的抗血清免疫荧光强度最高，与ELISA检测的抗体水平一致。取家兔抗血清对小鼠伯氏疟原虫粗提抗原进行蛋白质印迹（Western blot）分析，产生特异性反应条带，表明能够识别天然的PbAMA-1蛋白。免疫小鼠在以伯氏疟原虫攻击实验中得到部分保护，DⅠ、DⅡ、DⅢ 和E各免疫组小鼠与佐剂对照组相比，存活时间明显延长(t=2.78，P<0.05；t=2.67，P<0.05；t=3.46，P<0.01和t=3.50，P<0.01)。 结论 人工合成的PbAMA-1具有良好的免疫原性和免疫保护作用，完整的胞外区E较其各亚区表现出更好的免疫原性。
