粉尘螨6类变应原（Der f6）的克隆表达、纯化及免疫学特性鉴定

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ›› 2006, Vol. 24 ›› Issue (4): 1-246.

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粉尘螨6类变应原（Der f6）的克隆表达、纯化及免疫学特性鉴定

朱永烽;刘志刚;高波

1 深圳大学生命科学学院，深圳 518060； 2 深圳市微生物基因工程重点实验室，深圳 518060

收稿日期:1900-01-01 修回日期:1900-01-01 出版日期:2006-08-30 发布日期:2006-08-30
通讯作者: 刘志刚

Cloning， Expression， Purification and Identification of Der f6 Gene andits Immunological Characteristics from the Dust House Mite

ZHU Yong-feng;LIU Zhi-gang;GAO Bo

1 College of Life Sciences，Shenzhen University，Shenzhen 518060，China； 2 Shenzhen City Key Labo-ratory of Microbe Gene Engineering，Shenzhen 518060，China

Received:1900-01-01 Revised:1900-01-01 Online:2006-08-30 Published:2006-08-30
Contact: LIU Zhi-gang

摘要/Abstract

摘要： 目的构建粉尘螨6类变应原（Dermatophagoides farinae，Der f6）基因的高效原核表达载体，并进行表达、纯化及生物学功能分析。方法根据Der f6基因已知序列，设计1对引物，通过对纯培养的粉尘螨提取总RNA，采用RT-PCR方法扩增出Der f6基因片段，PCR产物克隆入pMD18-T载体，转化大肠埃希菌（E.coli Top10），经PCR和酶切鉴定并测序。将上述所得阳性克隆菌株扩大培养，碱裂解法提取质粒，所得重组质粒pMD18-T-Der f6和空质粒pET-24a同时用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，经纯化后连接并转化至E.coli Top10。构建的重组质粒pET24a-Der f6经PCR、酶切和测序鉴定后，再转化至E.coli BL21（DE3），异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western blotting）鉴定其表达效果，用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET24a-Der f6表达产生的组氨酸重组蛋白。结果构建了重组质粒pMD18-T-Der f6和pET24a-Der f6。SDS-PAGE 结果表明Der f6基因在E.coli Bl21(DE3）中获得良好的表达，所得重组蛋白相对分子质量(Mr) 为31 000, 与理论值一致, 经亲和层析纯化后，SDS-PAGE 结果显示单一条带。该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Western blotting, 结果表明具有良好的IgE结合活性。结论克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE结合活性的Der f6。

关键词: 粉尘螨, Der f6, 基因表达, 纯化, 蛋白质印迹

Abstract: Objective To construct, purify and characterize a recombinant expression plasmid containing Der f6 gene of Dermatophagoides farinae. Methods A pair of primers was designed according to the known sequence of Der f6 gene. The live mites identified and cultured locally were picked and the total RNA was extracted. The Der f6 gene fragment was amplified by RT-PCR，and cloned into pMD18-T vector， and then transferred into E.coli Top10. The target gene obtained from the recombinant plasmid by digestion with EcoRⅠ and XhoⅠ was connected to the prokaryotic expression vector pET-24a. The expressed recombinant plasmid containing Der f6 gene was constructed by cloning target gene into pET-24a and first transferred into E.coli Top10，then into E.coli Bl21（DE3）. The expressed recombinant protein was analyzed by SDS-PAGE and Western blotting，and was purified by immobilized metal ion affinity chromatography（IMAC）. Results The two recombinant plasmids，pMD18-T-Der f6 and pET24a-Der f6，were constructed. SDS-PAGE showed a correct molecular weight of the recombinant Der f6 protein. After purification by affinity chromatography，the protein showed only one strip on SDS-PAGE gel and appropriate combination ability with IgE in sera of allergic patients. Conclusion The Der f6 gene has been cloned into plasmid pMD18-T vector and sub-cloned into the expression vector pET-24a，the recombinant plasmid pET24a-Der f6 has been expressed in E.coli BL21（DE3），purified by IMAC，and showed approprriate IgE-combined ability.

Key words: Dermatophagoides farinae, Der f6, Expression, Purification, Western blotting

朱永烽;刘志刚;高波. 粉尘螨6类变应原（Der f6）的克隆表达、纯化及免疫学特性鉴定[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2006, 24(4): 1-246.

ZHUYong-feng;LIUZhi-gang;GAOBo. Cloning， Expression， Purification and Identification of Der f6 Gene andits Immunological Characteristics from the Dust House Mite[J]. Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases, 2006, 24(4): 1-246.

[1]	郭楚桐, 欧阳春艳, 何俊贤, 季树宇, 杨礼腾, 刘晓宇. 屋尘螨第十类变应原的克隆、表达、纯化及免疫原性分析[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2020, 38(6): 723-729.
[2]	成钢, 王芊薄, 龚强, 熊德慧. 东方田鼠HSP90α和KPNA2基因表达及体内抗日本血吸虫效果比较观察[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2019, 37(5): 552-556.
[3]	江贝, 肖小军, 欧阳春艳, 罗新萍, 孙宝清, 李靖, 刘志刚. 粉尘螨过敏原Der f 32的克隆、表达、免疫学鉴定及其对树突状细胞的调节作用研究[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2019, 37(3): 279-285.
[4]	茅光耀, 郭云海, 张仪, 肖宁. Cu²⁺胁迫对福寿螺金属硫蛋白基因mRNA表达的影响[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2019, 37(3): 375-378.
[5]	茅光耀, 周鸿让, 黄芸, 岳志远, 段磊, 许秋利, 郭云海, 党志胜, 张仪, 肖宁. Cu²⁺胁迫下福寿螺谷胱甘肽S转移酶基因表达分析[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2019, 37(2): 213-218.
[6]	袁义雪, 郑国侠, 王丹丹, 专行, 杜萌, 王云华. 蓝氏贾第鞭毛虫核苷二磷酸激酶基因的克隆与表达[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2019, 37(2): 190-193.
[7]	柴强, 宋红玉, 李朝品. 白细胞介素-33在过敏性哮喘小鼠体内的变化及作用[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2018, 36(2): 124-129.
[8]	袁义雪1，郑国侠2，王丹丹1，专行1，杜萌1，王云华1*. 蓝氏贾第鞭毛虫核苷二磷酸激酶基因的克隆与表达[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2018, 36(2): 190-192.
[9]	王楠1, 滕飞翔1, 俞黎黎1, 杨李1, 张承伯1, 周鹰1,2, 崔玉宝1,2*. 粉尘螨变应原Der f 8全长基因克隆及表达[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2017, 35(4): 8-351-356.
[10]	张浩1*, 马文静2, 何韶衡3. 德国小蠊变应原Bla g 2单克隆抗体的制备与鉴定[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2017, 35(4): 10-362-365.
[11]	于爱萍, 沈玉娟. 长链非编码RNA在寄生虫中的研究进展[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2017, 35(3): 294-299.
[12]	章乐生, 孙磊, 胡媛, 巩文词, 王燕娟, 沈玉娟, 徐馀信, 汪天平, 曹建平. 蓝氏贾第鞭毛虫单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2017, 35(2): 160-163.
[13]	段彬彬，宋红玉，李朝品*. 户尘螨Ⅱ类变应原Der p2 T细胞表位融合基因的克隆和原核表达[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2015, 33(4): 5-264-268.
[14]	莫丽华1，刘玉琳2，杨利桃3，范小琴3，刘志刚1，杨平常1 *. 粉尘螨过敏原β-己糖胺酶的表达、纯化和生物信息学分析[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2015, 33(2): 20-159-161.
[15]	姜玉新1 *, 尹康2, 靳文杰2, 吴露依2, 李朝品3. 粉尘螨变应原Der f 1 mRNA对小鼠特异性免疫治疗的实验研究[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2014, 32(4): 5-268-273.

粉尘螨6类变应原（Der f6）的克隆表达、纯化及免疫学特性鉴定

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