Cu2+胁迫对福寿螺金属硫蛋白基因mRNA表达的影响

doi:10.12140/j.issn.1000-7423.2019.03.025

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ›› 2019, Vol. 37 ›› Issue (3): 375-378.doi: 10.12140/j.issn.1000-7423.2019.03.025

Cu²⁺胁迫对福寿螺金属硫蛋白基因mRNA表达的影响

茅光耀(), 郭云海, 张仪, 肖宁^*()

中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所,国家热带病研究中心,世界卫生组织热带病合作中心,科技部国家级热带病国际联合研究中心,卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室,上海 200025

收稿日期:2018-11-30 出版日期:2019-06-30 发布日期:2019-07-10
通讯作者: 肖宁
作者简介:
作者简介：茅光耀（1993-）,男,在读硕士研究生,从事寄生虫病媒介生物研究。E-mail：maoguangyao1993@126.com
基金资助:
国家重点研发计划项目（No. 2016YFC1200500）

Effects of Cu²⁺ stress on the expression of metallothionein mRNA in Pomacea canaliculata

Guang-yao MAO(), Yun-hai GUO, Yi ZHANG, Ning XIAO^*()

National Institute of Parasitic Diseases, Chinese Center for Disease Control and Prevention;Chinese Center for Tropical Diseases Research;WHO Collaborating Centre for Tropical Diseases;National Center for International Research on Tropical Diseases, Ministry of Science and Technology;Key Laboratory of Parasite and Vector Biology, Ministry of Health, Shanghai 200025, China

Received:2018-11-30 Online:2019-06-30 Published:2019-07-10
Contact: Ning XIAO
Supported by:
Supported by the National Key Research and Development Program of China (No. 2016YFC1200500)

摘要/Abstract

摘要：

探讨不同浓度Cu²⁺胁迫对福寿螺肝胰腺组织金属硫蛋白（metallothionein,MT）基因表达的影响,取15只福寿螺,在100 μg/L Cu²⁺离子胁迫后的0、1、7、14、21 d,各取3只福寿螺,分离肝脏,提取RNA,反转录为cDNA,实时荧光定量PCR检测福寿螺金属硫蛋白基因（PcMT）mRNA的相对表达水平。以cDNA为模板,PCR扩增PcMT基因完整编码序列,连接至pET28a质粒,转入大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞中,挑取阳性克隆进行鉴定与测序。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表达产物。结果显示,Cu²⁺胁迫0~14 d,福寿螺肝脏中PcMT基因mRNA的表达量持续上升,峰值为2.1 ± 0.2,21 d时下降为1.1 ± 0.1。PCR扩增PcMT基因,获得长度约300 bp的片段,构建的pET28a-PcMT质粒经PCR、双酶切和测序鉴定,均与预期大小一致。SDS-PAGE结果显示,PcMT蛋白的相对分子质量（M_r）约为17 000。

关键词: 福寿螺, Cu²⁺胁迫, 金属硫蛋白, 基因表达分析

Abstract:

Fifteen Pomacea canaliculata were exposed to 100 μg/L Cu²⁺ for 0, 1, 7, 14 and 21 days. The total RNA was isolated from livers of three P. canaliculate at each time points and the expression level of P. canaliculate metallothionein (PcMT) mRNA was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The DNA coding for the full-length PcMT was amplified from P. canaliculata total cDNA, and then cloned into the bacterial expression vector pET28a. The recombinant plasmid DNA was sequenced to confirm the correct insert, then transformed into E. coil BL21 (DE3). The recombinant PcMT protein was expressed in BL21 under induction of IPTG and analyzed by SDS-PAGE. The results showed that the expression of PcMT mRNA in the liver of P. canaliculate was continuously upregulated upto 14 days under stress of 100 μg/L Cu²⁺ and reached to a peak value of 2.1 ± 0.2, then decreased to 1.1 ± 0.1 on Day 21. The full length DNA of PcMT gene was about 300 bp. The correct insert in the constructed recombinant pET28a-PcMT plasmid was confirmed by PCR, double digestion and DNA sequencing. The recombinant PcMT protein was successfully expressed in BL21 under induction of IPTG and conformed by SDS-PAGE with relative molecular weight (M_r) of 17 000. These results provide information for further study on the dynamic expression of PcMT in P. canaliculata under stress of heavy metals and its role in the viability of the snail.

Key words: Pomacea canaliculata, Cu²⁺ stress, Metallothionein, Gene expression analysis

中图分类号:

R383.19

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图/表 3

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Cu²⁺胁迫对福寿螺金属硫蛋白基因mRNA表达的影响

Effects of Cu²⁺ stress on the expression of metallothionein mRNA in Pomacea canaliculata

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