柳建发1,李健2,任怡静3,张瑞祥2,方芳3,胡薇2,4*
LIU Jian-fa1, LI Jian2, REN Yi-jing3, ZHANG Rui-xiang2, FANG Fang3, HU Wei2,4*
摘要:
目的 建立RNA干扰后的日本血吸虫转移至小鼠体内发育情况的评价技术,为后组学时代功能基因研究提供工具。 方法 设计引物扩增日本血吸虫组织蛋白酶B1(SjCB1)基因dsRNA、绿色荧光蛋白(GFP)dsRNA。用日本血吸虫尾蚴感染小鼠,收集14 d的日本血吸虫童虫。用6 mg/L SjCB1 dsRNA体外培养浸泡法对日本血吸虫童虫的SjCB1基因进行特异性敲低(SjCB1干扰组),对照组加6 mg/L GFP dsRNA(GFP干扰组)。采用外科手术将干扰后的童虫过继转移至小鼠肠系膜静脉(SjCB1干扰组、GFP干扰组各3只小鼠,40条/鼠),待虫体发育至性成熟时收集虫体。统计分析雌雄虫回收数量、合抱率、虫体回收率以及虫体长度,观察虫体生长发育情况。采用荧光定量PCR检测干扰后的14 d雌、雄童虫以及回收的雌、雄成虫SjCB1基因的表达情况。 结果 SjCB1干扰组、GFP干扰组回收的雌、雄虫数量,合抱率,虫体回收率分别为(9.0 ± 1.4)、(9.0 ± 2.1)条,(13.0 ± 2.9)、(11.3 ± 2.5)条,100%、100%和58.60%、54.67%。两组雌、雄虫数量,合抱率,虫体回收率差异均无统计学意义(P > 0.05)。SjCB1干扰组过继转移前雌、雄童虫SjCB1基因的相对表达量为1.022 ± 0.019、0.643 ± 0.105,均低于GFP干扰组的2.880 ± 0.297、2.753 ± 0.164(t = 0.000、0.000,P < 0.01);SjCB1干扰组回收的雌、雄虫SjCB1基因相对表达量分别为1.286 ± 0.211、1.182 ± 0.287,均低于GFP干扰组的5.506 ± 0.326、4.986 ± 1.230 (t = 0.013、0.000,P < 0.01)。SjCB1干扰组、GFP干扰组雌虫长分别为(7.059 ± 1.255) 、(8.433 ± 0.749) cm,雄虫长分别为(6.993 ± 2.734)、(10.561 ± 1.375) cm,两组间雌、雄虫差异有统计学意义(t = 0.003、0.001,P < 0.01)。SjCB1干扰组、GFP干扰组虫体外观形态及内部的生殖系统、消化系统未见差异,两组雌虫在卵模与子宫中均有成形的虫卵。 结论 建立了干扰特异性基因后观察虫体体内发育表型的技术,体外培养浸泡干扰后日本血吸虫童虫、成虫SjCB1基因表达水平被显著敲低,该方法可用于研究发育相关基因的表型。