粉尘螨变应原Der f 1 mRNA对小鼠特异性免疫治疗的实验研究

摘要/Abstract

摘要：

目的探讨粉尘螨变应原Der f 1 mRNA疫苗对哮喘小鼠的特异性免疫治疗效果。方法 50只BALB/c小鼠随机分为5组（10只/组），分别为PBS组、Der f 1 变应原致敏组、Der f 1 变应原免疫治疗组、β-actin mRNA免疫治疗组和Der f 1 mRNA免疫治疗组。分别于第0、第7和第14天，PBS组小鼠腹腔注射PBS，其余4组小鼠则腹腔注射10 μg Der f 1进行致敏，建立小鼠哮喘模型。自第21天起，除PBS组小鼠雾化吸入PBS，其他4组小鼠均雾化吸入100 μg/ml Der f 1 变应原，30 min/次，1次/d，连续7 d，观察并记录小鼠哮喘发作情况。5组小鼠于最后1次雾化吸入致敏2周后，背部皮下分别注射100 μl PBS、1 μg Der f 1 （维持致敏）、10 μg Der f 1 （免疫治疗）、2 μg β-actin mRNA和2 μg Der f 1 mRNA，1次/周，连续3周。最后1次皮下注射后2周处死小鼠。收集各组小鼠的支气管肺泡灌洗液（BALF），ELISA法检测γ干扰素（IFN-γ）和白介素13（IL-13）水平，并计数嗜酸粒细胞（EOS）；收集各组小鼠脾组织，分离脾细胞，除PBS组外，其他4组均加入10 μg/ml Der f 1培养72 h，ELISA法检测脾细胞培养上清液中IFN-γ和IL-13水平；取各组小鼠眼球血，ELISA法检测血清中总IgE以及变应原特异性IgE（sIgE）、IgG1（sIgG1）和IgG2a（sIgG2a）抗体水平。HE染色观察各组小鼠肺组织切片。　结果除PBS组外，其他4组小鼠雾化吸入致敏后，均出现急性哮喘发作症状。小鼠BALF中，Der f 1 mRNA 免疫治疗组和Der f 1 免疫治疗组的IFN-γ水平分别为（897.56±105.73）和（864.48±70.62）pg/ml，均明显高于Der f 1 变应原致敏组［（209.05±52.28）pg/ml］和β-actin mRNA免疫治疗组［（219.47±64.72）pg/ml］（P<0.01）；两者IL-13水平分别为（241.64±31.41）和（321.94±41.07）pg/ml，则明显低于Der f 1 变应原致敏组［（520.62±43.77）pg/ml］和β-actin mRNA免疫治疗组［（507.22±42.26）pg/ml］（P<0.01）；两者EOS数量分别为（1.33±0.44）×10⁵和（1.48±0.39）×10⁵个/ml，均明显低于Der f 1 变应原致敏组［（3.54±0.52）×10⁵个/ml］和β-actin mRNA免疫治疗组［（2.98±0.53）×10⁵个/ml］（P<0.01）。脾细胞培养上清的ELISA检测结果显示，Der f 1 mRNA免疫治疗组和Der f 1 免疫治疗组的IFN-γ水平分别为（420.91±69.92）和（334.92±43.72）pg/ml，明显高于Der f 1 变应原致敏组［（123.75±15.48）pg/ml］和β-actin mRNA免疫治疗组［（128.84±59.00）pg/ml］（P<0.01）；两者IL-13水平［（268.51±40.42）和［（285.26±62.21）pg/ml］则显著低于Der f 1 变应原致敏组［（613.89±51.54）pg/ml］和β-actin mRNA免疫治疗组［（524.05±39.12）pg/ml］（P<0.01）。血清中抗体水平的ELISA检测结果显示，Der f 1 mRNA免疫治疗组的总IgE、sIgE和sIgG1抗体水平分别为（33.72±9.78）、（22.76±8.09）和（17.87±7.59）ng/ml，均显著低于Der f 1 变应原致敏组［（94.34±11.66）、（65.67±9.47）和（75.18±9.52）ng/ml］和β-actin mRNA免疫治疗组［（86.48±10.26）、（62.36±8.35）和（69.51±8.98）ng/ml］（P<0.01）；其sIgG2a抗体水平为（7.74±0.88）ng/ml，则明显高于Der f 1 变应原致敏组［（2.81±1.17）ng/ml］和β-actin mRNA免疫治疗组［（1.06±0.11）ng/ml］（P<0.01）。肺组织切片HE染色镜检结果显示，与Der f 1 变应原致敏组相比，Der f 1 mRNA免疫治疗组小鼠的气道上皮和肺泡上皮细胞结构基本完整，炎症细胞浸润明显减少。　结论 Der f 1 mRNA疫苗可有效纠正Th1/Th2失衡。

关键词: 粉尘螨, 变应原, mRNA疫苗, 特异性免疫治疗

Abstract:

Objective To investigate the effect of Der f 1 mRNA molecules for specific immunotherapy on murine model of asthma. Methods Fifty BALB/c mice were randomly divided into 5 groups： PBS group， Der f 1 sensitization group， Der f 1 specific immunotherapy（SIT） group， β-actin mRNA SIT group， and Der f 1 mRNA SIT group. On days 0， 7 and 14， mice in PBS group received PBS injection； mice in the other groups were intraperitoneally injected with 10 μg Der f 1. At day 21， the mice in the 4 experimental groups were challenged with a 30-min inhaled dose of Der f 1（100 μg/ml） for 7 successive days. Two weeks after the final sensitization， the mice in the above five groups were immunized by intradermal injection with PBS， 1 μg Der f 1， 10 μg Der f 1， 2 μg β-actin mRNA， and 2 μg Der f 1 mRNA， respectively for 3 times at one-week intervals. Two weeks after the last intradermal injection， all mice were sacrificed and bronchoalveolar lavage fluid （BALF） was collected. ELISA was performed to detect the levels of IFN-γ and IL-13 in BALF， the number of eosinophils in the BALF was recorded. Splenocytes were prepared， and cultured with Der f 1 allergen （10 μg/ml） for 72 h. Splenocytes of PBS group was cultured without Der f 1 allergen. The levels of IFN-γ and IL-13 in splenocyte culture supernatant were measured by ELISA， as well as serum antibody levels of total IgE， allergen-specific IgE （sIgE）， sIgG1， and sIgG2a. Lung sections were stained in hematoxylin and eosin, and observed under the microsope. Results Except for PBS group， mice in the other 4 group showed symptoms of acute asthma attack. Compared with Der f 1 sensitization group ［（897.56±105.73） pg/ml］ and β-actin mRNA SIT group ［（219.47±64.72） pg/ml］， the level of IFN-γ in BALF from Der f 1 mRNA SIT group ［（897.56±105.73） pg/ml］ and Der f 1 SIT group ［（864.48±70.62）pg/ml］ significantly increased（P<0.01）. However， the level of IL-13 in BALF from Der f 1 mRNA SIT group ［（241.64±31.41） pg/ml］ and Der f 1 SIT group ［（321.94±41.07）pg/ml］ was significantly lower than that of Der f 1 sensitization group ［（520.62±43.77） pg/ml］ and β-actin mRNA SIT group ［（507.22±42.26） pg/ml］（P<0.01）. The number of eosinophils in Der f 1 mRNA SIT group ［（1.33±0.44）×105/ml］ and Der f 1 SIT group ［（1.48±0.39）×105/ml］ was also lower than that of Der f 1 sensitization group ［（3.54±0.52）×105/ml］ and β-actin mRNA SIT group ［（2.98±0.53）×105/ml］（P<0.01）. The levels of IFN-γ and IL-13 in splenocyte culture supernatant showed that IFN-γ level in Der f 1 mRNA SIT group ［（420.91±69.92） pg/ml］ and Der f 1 SIT group ［（334.92±43.72） pg/ml］ was significantly higher than that of Der f 1 sensitization group［（123.75±15.48） pg/ml］ and β-actin mRNA SIT group［（128.84±59.00） pg/ml］（P<0.01）. However， IL-13 level of Der f 1 mRNA SIT group ［（268.51±40.42） pg/ml］ and Der f 1 SIT group ［（285.26±62.21）pg/ml］ was significantly lower than that of Der f 1 sensitization group ［（613.89±51.54） pg/ml］ and β-actin mRNA SIT group ［（524.05±39.12） pg/ml］（P<0.01）. Compared with Der f 1 sensitization group ［total IgE：（94.34±11.66） ng/ml， sIgE：（65.67±9.47） ng/ml， sIgG1：（75.18±9.52） ng/ml， sIgG2a：（2.81±1.17） ng/ml］ and β-actin mRNA SIT group［total IgE：（86.48±10.26） ng/ml， sIgE：（62.36±8.35） ng/ml， sIgG1：（69.51±8.98） ng/ml， IgG2a：（1.06±0.11） ng/ml］， the serum antibody levels of total IgE ［（33.72±9.78） ng/ml］， sIgE ［（22.76±8.09） ng/ml］， sIgG1 ［（17.87±7.59） ng/ml］ of Der f 1 mRNA SIT group decreased significantly（P<0.01）， whereas the level of IgG2a ［（7.74±0.88） ng/ml］ increased（P<0.01）. Compared with Der f 1 sensitization group， the asthmatic symptoms were relieved after immunization with Der f 1 mRNA for specific immunotherapy， including intact structure of respiratory and alveolar epithelial cells， decreased inflammatory cell infiltration， and similar to those in Der f 1 SIT group. However， the breakage and detachment of bronchial epithelial cells occurred in β-actin mRNA SIT group. Conclusion Der f 1 mRNA vaccine can correct Th1 and Th2 imbalance.

Key words:

Dermatophagoides farinaemso-ascii-font-family: Calibri, mso-ascii-theme-font: minor-latin, mso-fareast-font-family: 宋体, mso-fareast-theme-font: minor-fareast, mso-hansi-font-family: Calibri, mso-hansi-theme-font: minor-latin">；Allergenmso-ascii-font-family: Calibri, mso-ascii-theme-font: minor-latin, mso-fareast-font-family: 宋体, mso-fareast-theme-font: minor-fareast, mso-hansi-font-family: Calibri, mso-hansi-theme-font: minor-latin">；mRNA vaccinemso-ascii-font-family: Calibri, mso-ascii-theme-font: minor-latin, mso-fareast-font-family: 宋体, mso-fareast-theme-font: minor-fareast, mso-hansi-font-family: Calibri, mso-hansi-theme-font: minor-latin">；Specific immunotherapy

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粉尘螨变应原Der f 1 mRNA对小鼠特异性免疫治疗的实验研究

Experimental Study on the Der f 1 mRNA Molecules Derived from Dermatophagoides farinae for Specific Immunotherapy on Murine Model of Asthma

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