中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ›› 2012, Vol. 30 ›› Issue (5): 1-335-340.
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刘建1,徐斌2,张晓1,2,刘璐1,2,胡薇2,3,王小宁1 *
LIU Jian 1,XU Bin 2,ZHANG Xiao 1,2,LIU Lu 1,2,HU Wei 2,3,WANG Xiao-ning 1 *
摘要: 【摘要】 目的 克隆、表达日本血吸虫硫氧还蛋白-1(SjTrx-1)编码基因,测定重组SjTrx-1蛋白的酶催化活性,分析SjTrx-1基因在血吸虫不同发育阶段的转录本差异,观察其在日本血吸虫成虫体内的组织分布情况。 方法 从日本血吸虫cDNA文库中挑选SjTrx-1的基因序列,应用PCR技术对目的片段进行体外扩增,并克隆入原核表达载体pET28a,重组质粒转化E. coli BL21(DE3)细胞,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物,二硫苏糖醇(DTT)/胰岛素还原法测定重组SjTrx-1蛋白的酶催化活性。纯化的重组SjTrx-1蛋白免疫新西兰白兔,以制备的免疫兔血清作为抗体,应用免疫荧光定位技术检测SjTrx-1在日本血吸虫成虫体内的分布情况。制备日本血吸虫各虫期的总RNA样品,利用RT-PCR方法扩增目的片段,分析SjTrx-1基因在各发育阶段的转录本丰度。 结果 构建了重组表达载体SjTrx-1/pET28a,在E. coli中实现了重组SjTrx-1蛋白的可溶表达,其相对分子质量(Mr)约为38 000,与预测的融合蛋白大小相符。经组氨酸标签亲和层析法获得纯化重组蛋白SjTrx-1,并测定了其体外的酶催化活性。虫期转录特异性分析显示,该基因在各个虫期均存在转录,其中胞蚴、童虫和成虫阶段的丰度较高,毛蚴和尾蚴中含量相对较低。荧光定位结果显示,SjTrx-1蛋白在虫体内分布广泛,且无组织特异性。 结论 SjTrx-1在日本血吸虫虫体内分布广泛,在胞蚴、童虫和成虫阶段的丰度较高。