中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ›› 2012, Vol. 30 ›› Issue (4): 5-274-278.
郭伟,姜玉新,李朝品*
GUO Wei, JIANG Yu-xin, LI Chao-pin*
摘要: 目的 原核表达尘螨1类变应原(粉尘螨1类变应原Derf1和户尘螨1类变应原Derp1基因)的嵌合基因R8,并检测其生物活性。 方法 以含嵌合基因R8的pUCm-T重组质粒为模板,用Derf1的特异性引物进行PCR扩增,产物经酶切后与载体pET28a(+)连接,连接产物转入大肠埃希菌(E. coli)BL21感受态细胞,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后纯化,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测;纯化后的蛋白用ELISA检测其与粉尘螨过敏患者血清(IgE)的结合能力,同时以重组rDer f 1和rDer p 1蛋白作为对照。为检验嵌合蛋白R8的免疫原性,将75只BALB/c小鼠随机均分为5组,分别为PBS组(阴性对照组)、rDer f 1组、rDer p 1组、R8组和哮喘组(阳性对照组)。除PBS组外,其余各组分别于第0、7和14天每鼠腹腔注射(0.1 μg/μl)粉尘螨注射液100 μl,第21~27天每鼠每天雾化吸入0.5 μg/ml粉尘螨注射液悬浊液,30 min/d。rDer f 1组、rDer p 1组和R8组于第25~27天雾化前30 min,分别腹腔注射100 μg/ml的rDer f 1、rDer p 1和R8蛋白各200 μl进行特异性免疫治疗,PBS组用等量PBS进行腹腔注射和雾化吸入。所有小鼠于第27天雾化吸入后24 h气管切开,用1 ml PBS进行肺泡灌洗,收集肺泡灌洗液(BALF),检测γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4 (IL-4)的水平。 结果 SDS-PAGE结果显示,R8表达产物的蛋白相对分子质量(Mr)约为35 000。ELISA检测结果显示,嵌合蛋白R8与粉尘螨过敏患者血清IgE的结合力为(37.03±12.46)μg/ml,显著低于rDer f 1[(80.44±15.50)μg/ml]和rDer p 1[(90.79±10.38)μg/ml](P<0.01)。动物实验结果显示,R8组IFN-γ水平[(343.43±38.79)pg/ml]与rDer f 1组[(322.98±30.36) pg/ml]和rDer p 1组[(314.97±33.89) pg/ml]的相比,差异均无统计学意义(P>0.05);与PBS组[(393.93±50.68)pg/ml]和哮喘组[(208.44±46.11)pg/ml]相比,差异均有统计学意义(P<0.01)。R8组IL-4水平显著低于其他各组水平(P<0.05或0.01)。 结论 表达了具有低变应原性和高免疫原性的尘螨1类变应原嵌合基因R8。