中华按蚊实验室种群中肠内细菌菌群分析

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ›› 2010, Vol. 28 ›› Issue (2): 13-147.

中华按蚊实验室种群中肠内细菌菌群分析

李美，汤林华^*

中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室，世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心，上海 200025

收稿日期:1900-01-01 修回日期:1900-01-01 出版日期:2010-04-30 发布日期:2010-04-30
通讯作者: 汤林华

The Midgut Bacterial Flora in Lab-Reared Anopheles sinensis

LI Mei，TANG Lin-hua^*

National Institute of Parasitic Diseases，Chinese Center for Disease Control and Prevention；Key Laboratory of Parasite and Vector Biology，MOH；WHO Collaborating Centre for Malaria，Schistosomiasis and Filariasis，Shanghai 200025，China

Received:1900-01-01 Revised:1900-01-01 Online:2010-04-30 Published:2010-04-30
Contact: TANG Lin-hua

摘要/Abstract

摘要： 目的为获取实验室饲养的3个发育期中华按蚊中肠内的革兰氏阴性菌菌株。方法取实验室饲养的20只中华按蚊吸血成蚊的中肠，研磨稀释后涂板培养，挑取单个菌落，培养扩增。以各菌株的DNA为模板，对16S rRNA基因的V3高变区进行PCR扩增、测序和Blast分析。对经鉴定的各类细菌进行革兰氏染色。以中华按蚊的Ⅳ龄幼虫（10只）、刚羽化雌成蚊（50只）和吸血雌成蚊（20只）等3个发育期的中肠基因组DNA为模板，用变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）分析3个发育期中肠细菌16S rDNA V3区序列；建立在3个发育期均存在的16S rDNA V3区的克隆文库，并进行测序分析。将两种方法获得的16S rDNA V3区序列进行亲缘关系分析，确定同种的革兰氏阴性菌。结果从吸血成蚊的中肠分离到28个菌株，经分类鉴定为5种细菌，除短芽孢杆菌革兰氏染色呈阳性外，气单孢菌、丛毛单胞菌、金黄杆菌和A4菌均为革兰氏阴性菌。DGGE分析显示，共检测到4组条带在3个发育期均存在，经序列分析来源于5种细菌，分别为气单孢菌、A4菌、假单胞菌、无色杆菌和某未知菌种，其中气单孢菌（GQ301543）和A4菌（FJ8701127）来源的16S rDNA V3区与分离得到的该两种菌株的序列一致性均为100%。结论获得2种在中华按蚊3个发育期中肠内均存在的革兰氏阴性菌株，分别为气单孢菌和A4菌。

关键词: 中华按蚊, 细菌菌群, 克隆文库, 变性梯度凝胶电泳, 革兰氏阴性菌

Abstract: Objective To screen Gram-negative bacteria in the midguts of lab-reared Anopheles sinensis at 3 development stages （larva, unfed adult and engorged adult）. Methods Twenty engorged adult An. sinensis mosquitoes were dissected, and bacteria were isolated from their midguts by plate cultivation. The bacteria were identified by using 16S rDNA V3 sequence and dyed with Gram-reaction solutions. Using denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）, 16S rDNA clone libraries from common bacteria in the midguts of lab-reared An. sinensis at 3 development stages （20 engorged adults, 10 larva and 50 unfed adults） were constructed. Target Gram-negative bacteria were screened by phylogenetic analysis of all 16S rDNA V3 sequences. Results In engorged adult female An. sinensis, 16S rRNA sequencing placed the 28 screened bacterial colonies with their closest matches into 5 major groups. Except Gram-positive Brevibacillus sp., the other four, Aeromonas sp., Comamonas sp., Elizabethkingia sp.， and A4 were Gram-negative. DGGE analysis showed that 4 distinct bands existed in 3 development stages of An. sinensis. 16S rDNA V3 segments revealed 5 species of bacteria which were Aeromonas sp., A4, Pseudomonas sp., Leucobacter sp.， and one unclassified bacterium. Compared with 16S rDNA V3 region of Aeromonas sp. （GQ301543） and A4（FJ8701127）, the matching 16S rDNA segments of midgut bacteria of engorged adults showed a nucleotide sequence similarity of 100%. Conclusion Aeromonas sp. and A4 were the common midgut Gram-negative bacteria of An. sinensis at 3 development stages.

Key words: Anopheles sinensis, Bacterial flora, Clone liberary, Denaturing gradient gel electrophoresis, Gram-negative bacteria

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