采用实时PCR技术比较不同方法提纯

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ›› 2009, Vol. 27 ›› Issue (2): 8-134.

采用实时PCR技术比较不同方法提纯

陈盛霞^1，2，吴亮²，沈玉娟¹，章秋霞²，李婷婷²，姜旭淦²，徐馀信¹，曹建平^{1 *}

1 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室，世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心，上海 200025； 2 江苏大学基础医学与医学技术学院，镇江 212013

收稿日期:1900-01-01 修回日期:1900-01-01 出版日期:2009-04-30 发布日期:2009-04-30

Real-time PCR in Analyzing DNA Extraction from Cryptosporidium Oocysts

CHEN Sheng-xia^1，2，WU Liang²，SHEN Yu-juan¹，ZHANG Qiu-xia²，
LI Ting-ting²，JIANG Xu-gan²，XU Yu-xin¹，CAO Jian-ping^{1 *}

1 National Institute of Parasitic Diseases，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Key Laboratory of Parasite and Vector Biology，MOH，WHO Collaborating Centre for Malaria, Schistosomiasis and Filariasis，Shanghai 200025，China；2 School of Medical Science and Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China

Received:1900-01-01 Revised:1900-01-01 Online:2009-04-30 Published:2009-04-30

摘要/Abstract

摘要： 目的比较不同方法提纯隐孢子虫卵囊DNA的效果。方法将分离纯化的隐孢子虫卵囊分别加入美国Promega公司（简称Promega）和上海捷瑞公司（简称捷瑞）基因组DNA纯化试剂盒的裂解液、2% Triton X-100和5% 异硫氰酸胍，同时联合使用冻融法、蛋白酶K法和声裂法裂解卵囊，用试剂盒法或Chelex-100法提纯卵囊基因组DNA，用实时PCR测定隐孢子虫卵囊囊壁蛋白（COWP）基因拷贝数，以Promega试剂盒为参照比较不同纯化方法的提纯效果。结果 Promega试剂盒的裂解液裂解隐孢子虫卵囊的效果最好，纯化所得卵囊COWP基因拷贝数可达（6.45～9.86）×106；其他依次为捷瑞试剂盒的裂解液[（2.38～3.69）×106]、5%异硫氰酸胍[（1.27～21.29）×105]和2% Triton X-100[（2.06～866.70）×103]。冻融法+蛋白酶K法+声裂法提纯隐孢子虫卵囊DNA效果最佳，其次为冻融法+声裂法和蛋白酶K法+声裂法，冻融法+蛋白酶K法效果最差。结论冻融法+蛋白酶K法+声裂法联合使用能使卵囊DNA的提纯效率达到最大，捷瑞基因组DNA纯化试剂盒和5%异硫氰酸胍裂解法提纯隐孢子虫卵囊DNA可获得与Promega试剂盒相近的效果。

关键词: 隐孢子虫, 卵囊, 实时PCR, DNA, 提纯

Abstract: Objective To compare the quality and quantity of DNA extracted from Cryptosporidium oocysts by different methods. Methods Cryptospordium oocysts were treated with different kinds of lysis buffers from USA Promega（Promega）and Shanghai Generay（Generay）commercial DNA extraction kits，2% Triton X-100 and 5% guanidine thiocyanate. The oocysts were then broken down by freeze-thawing，proteinase K and sonication. Genomic DNA was purified using the commercial kits or Chelex-100. Real-time PCR technique was used to determine the copies of Cryptosporidium oocyst wall protein（COWP）gene. The Promega commercial DNA extraction kit was used as control. Results The Promega kit resulted in a higher copy number of COWP gene[（6.45-9.86）×106]than that of Generay commercial DNA kit [（2.38-3.69）×106 ], 5% guanidine thiocyanate[（1.27-21.29）×105] or 2% Triton X-100 [（2.06-866.70）×103], respectively. The method of freeze-thawing plus proteinase K plus sonication provided the highest copy number of COWP gene. Conclusion The method of freeze-thawing + proteinase K + sonication is most effective. The effect of DNA extraction by Generay kit and 5% guanidine thiocyanate is similar to that of Promega kit.

Key words: Cryptosporidium, Oocyst, Real-time PCR, DNA, Extraction

陈盛霞;吴亮;沈玉娟;章秋霞;李婷婷;姜旭淦;徐馀信;曹建平. 采用实时PCR技术比较不同方法提纯[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2009, 27(2): 8-134.

CHENSheng-xia;WULiang;SHENYu-juan;ZHANGQiu-xia;LITing-ting;JIANGXu-gan;XUYu-xin;CAOJian-ping*. Real-time PCR in Analyzing DNA Extraction from Cryptosporidium Oocysts[J]. Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases, 2009, 27(2): 8-134.

[1]	陈慧林, 朱永航, 范海页, 赵薇, 刘璐瑶, 曹玉祥, 叶长江, 孙恩涛. 基于18S和28S rDNA基因的房舍甲螨DNA条形码比较研究[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2023, 41(2): 163-169.
[2]	秦源, 刘华, 姜岩岩, 曹建平, 沈玉娟. 宁波市腹泻患者隐孢子虫分子鉴定及基因特征分析[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2023, 41(2): 202-208.
[3]	张耀光, 江莉, 王真瑜, 朱民, 朱倩, 马晓疆, 余晴, 陈健. 2020—2021年上海市7例输入性疟疾病例误判原因分析[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2023, 41(1): 68-74.
[4]	李腾, 沈玉娟, 崔丽君, 刘华, 胡媛, 姜岩岩, 曹建平. 长链非编码RNA NEAT1通过调控IL-8参与肠上皮细胞抗隐孢子虫反应[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2022, 40(4): 487-492.
[5]	陈远才, 黄建营, 李俊强, 张龙现. 中国奶牛源微小隐孢子虫分子流行病学及其亚型分布[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2022, 40(3): 278-284.
[6]	马琳, 张铮, 王安礼, 刘东立. 检测利什曼原虫的实时荧光定量PCR的建立及应用[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2021, 39(4): 548-552.
[7]	姜岩岩, 袁忠英, 沈玉娟, 徐宁, 张仁利, 黄达娜, 曹建平. 深圳某引种奶牛场奶牛感染隐孢子虫的分子特征[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2020, 38(6): 718-722.
[8]	尚婧晔, 张光葭, 喻文杰, 何伟, 廖沙, 李汭芮, 黄燕, 刘阳, 钟波. 多房棘球绦虫遗传多态性研究进展[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2020, 38(5): 637-641.
[9]	谭潇, 肖楚丽, 肖非, 王硕, 卿蕊, 黄泽智. IL-18增强pcDNA3.1/SjOST48抗血吸虫感染的免疫保护性研究[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2020, 38(3): 279-285.
[10]	牛子文, 常艳凯, 王克, 张龙现. 隐孢子虫体外培养模型研究进展[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2020, 38(3): 394-399.
[11]	邓王平, 徐斌, 洪清华, 王盛琳, 吕超, 李银龙, 宋世平, 陈军虎, 许静, 李石柱, 胡薇, 周晓农. 重组酶聚合酶扩增结合电化学DNA传感器检测日本血吸虫方法的建立[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2020, 38(2): 168-174.
[12]	周亚玲, 吴亮, 阴晴, 吴瑶, 何蕾, 邹治情, 戴晓玥, 夏雯. 慢性腹泻患者艰难梭菌、人芽囊原虫和隐孢子虫感染的研究[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2019, 37(6): 723-726.
[13]	田春艳, 陈蓓, 卢帅, 文丽梅, 赵军, 郑璇, 库尔班泥沙·阿马洪, 高旖, 王建华. 阿霉素体外抗细粒棘球蚴原头节作用研究[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2019, 37(5): 571-576.
[14]	胡坤敏, 郑彬, 陈韶红, 艾琳. 并殖吸虫DNA分类技术的研究进展[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2019, 37(5): 598-602.
[15]	贾丁, 但佳明, 孙燕, 罗静怡, 朱子琦, 张雪萍, 刘海峰, 周紫峣, 马晓平, 彭广能, 钟志军. 四川省奶牛犊牛隐孢子虫流行情况及其分子特性分析[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2019, 37(4): 422-427.