中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ›› 2005, Vol. 23 ›› Issue (1): 5-23.
张咏莉,余新炳,吴德,吴忠道,毕惠祥
ZHANG Yong-li;YU Xin-bing *;WU De;WU Zhong-dao;BI Hui-xiang
摘要: 目的 构建华支睾吸虫成虫转录辅激活因子 (transcriptionalcoactivator ,TC)基因 (TC基因 )原核重组质粒 ,进行原核表达、鉴定及生物功能分析。 方法 根据TC基因已知序列设计 1对引物 ,从华支睾吸虫成虫cDNA文库中扩增TC基因片段 ;将目的基因进行聚合酶链反应 (PCR) ,其产物和空质粒 pGEX-4T-1、pET30a (+ )同时用限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ双酶切 ,纯化回收后连接并转化大肠埃希菌 (E .coli BL21)。将构建的重组质粒pGEX-4T-1-TC和 pET30a (+ )-TC分别经双酶切、PCR及测序鉴定后在大肠埃希菌BL21中诱导表达。用十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)和蛋白质印迹法 (Western blotting)鉴定其表达效果 ,用亲和层析法纯化重组质粒pET30a (+ )-TC表达产生的组氨酸重组蛋白 (His-TC)。 结果 构建了TC基因原核重组质粒pGEX-4T-1-TC和 pET30a (+ )-TC。SDS-PAGE结果表明TC基因在大肠埃希菌BL21系统获得高效表达 ,其重组蛋白分子量与理论值相符。Western blotting结果表明重组质粒 pGEX-4T-1-TC表达的谷胱甘肽硫转移酶 (GST)重组蛋白(GST-TC)可被华支睾吸虫免疫兔血清识别 ,具有免疫反应性。纯化的TC基因的组氨酸 (His)重组蛋白 (His-TC)经SDS-PAGE显示单一条带。 结论 通过生物信息学方法由华枝睾吸虫成虫cDNA文库中筛选出TC基因,并成功予以克隆,表达及纯化。