聚合酶链反应结合非放射性标记探针检测粪便中微小隐孢子虫

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ›› 1998, Vol. 16 ›› Issue (4): 246-250.

聚合酶链反应结合非放射性标记探针检测粪便中微小隐孢子虫

陈雅棠; 马良

重庆医科大学传染病寄生虫病研究所

收稿日期:1900-01-01 修回日期:1900-01-01 出版日期:1998-08-28 发布日期:1998-08-28

DETECTION OF CRYPTOSPORIDIUM PARVUM IN FECAL SAMPLES USING POLYMERASE CHAIN REACTION COMBINED WITH NON RADIOACTIVE LABELED DNA PROBE HYBRIDIZATION

Chen Yatang; Ma Liang

Institute of Infectious and Parasitic Diseases; Chongqing University of Medical Sciences; Chongqing 630042

Received:1900-01-01 Revised:1900-01-01 Online:1998-08-28 Published:1998-08-28

摘要/Abstract

摘要：

目的：利用非放射性标记探针技术检测经聚合酶链反应扩增后的人粪便中微小隐孢子虫DNA，观察该方法的特异性和敏感性。方法：用裂解法从粪便标本直接制备微小隐孢子虫模板DNA，用一对人工合成的寡核苷酸作PCR引物，扩增长度为452bp的微小隐孢子虫目的DNA片段。将扩增产物直接点在或经Southern印迹法转移到硝酸纤维素膜上，再和生物素标记的寡核苷酸探针杂交，经底物（BCIP）呈色观察。结果：阳性杂交信号只见于微小隐孢子虫DNA扩增产物，而约氏疟原虫、杜氏利什曼原虫、贾第虫、白色念珠菌、大肠杆菌和人白细胞DNA均无杂交信号。PCR结合斑点杂交或Southern印迹法检测隐孢子虫DNA 的敏感性均为011 pg。结论: 非放射性探针检测人粪便隐孢子虫DNA 的PCR 扩增产物, 具有敏感性高、特异性强、操作较简便及无放射性污染等优点。

关键词: 微小隐孢子虫, 聚合酶链反应, 探针, 生物素

Abstract:

AIM: To develop a non radioactive labeled probe hybridization technique for the detection of the PCR products of Cryptosporidium parvum DNA in fecal samples and evaluate its specificity and sensitivity. METHODS: DNA of C.parvum was prepared directly from C.parvum infected patients fecal samples by the direct lysis method, and was used as the template for PCR. A pair of oligonucleotide primers was synthesized and used to prime the amplification of a 452 bp target fragment specific for C. parvum. The PCR products were directly spotted or transferred on to NC membrane. Then, the PCR products were hybridized with the biotin-labeled oligonucleotide probe and coloured by a substrate BCIP ( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate). RESULTS: Positive hybridized signals were only showed in the PCR products of DNA extracted from the fecal samples of C. parvum infected patients, but not in the other DNA of P.yoelii, L. donovani, G. lamblia, C. albicans, E. coli and human leucocytes. The lowest detectable amount of both dotor Southern blotting hybridization was 0.1 pg of C. parvum DNA. CONCLUSION: A combination of PCR and non-radioactive biotin-labeled probehybridization assay is highly sensitive, specific, and relatively simple and safe for the detection of the PCR products of C. parvum in fecal samples.

Key words: Cryptosporidium parvum, polymerase chain reaction, probe, biotin

陈雅棠;马良. 聚合酶链反应结合非放射性标记探针检测粪便中微小隐孢子虫[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 1998, 16(4): 246-250.

ChenYatang;MaLiang. DETECTION OF CRYPTOSPORIDIUM PARVUM IN FECAL SAMPLES USING POLYMERASE CHAIN REACTION COMBINED WITH NON RADIOACTIVE LABELED DNA PROBE HYBRIDIZATION[J]. Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases, 1998, 16(4): 246-250.

[1]	章乐生, 王旗, 汪峰峰, 朱海, 李清越, 马晓荷, 汪敏, 王毓洁, 汪天平, 操治国. 多酶恒温快速扩增技术结合荧光探针快速检测日本血吸虫基因方法的建立[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2024, 42(4): 481-486.
[2]	杨玲, 王龙, 王佳阳, 周坤铮, 闫宝龙, 赵威, 黄慧聪. 微小隐孢子虫GP900^829~1099蛋白的表达及其对小鼠巨噬细胞的免疫调节作用[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2024, 42(1): 55-62.
[3]	李腾, 沈玉娟, 崔丽君, 刘华, 胡媛, 姜岩岩, 曹建平. 长链非编码RNA NEAT1通过调控IL-8参与肠上皮细胞抗隐孢子虫反应[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2022, 40(4): 487-492.
[4]	陈远才, 黄建营, 李俊强, 张龙现. 中国奶牛源微小隐孢子虫分子流行病学及其亚型分布[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2022, 40(3): 278-284.
[5]	张逸龙, 叶润, 勒斌, 陈文柱, 潘卫庆, 张冬梅. 基于逆转录-酶促重组等温扩增原理的西尼罗病毒基因检测方法的建立[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2022, 40(3): 344-348.
[6]	马琳, 张铮, 王安礼, 刘东立. 检测利什曼原虫的实时荧光定量PCR的建立及应用[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2021, 39(4): 548-552.
[7]	赵松, 刘燕红, 李婷, 李伟, 张键锋, 郭利川, 应清界, 羊海涛, 杨坤. 结合重组酶介导的核酸等温扩增和荧光探针快速检测日本血吸虫基因片段[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2019, 37(1): 23-27.
[8]	汲蕊, 梁瑞文, 管志玉, 李瑞芳, 付玉荣, 王红艳. 氧化苦参碱对微小隐孢子虫感染小鼠肠黏膜Toll样受体的影响[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2018, 36(5): 455-460.
[9]	汲蕊, 梁瑞文, 管志玉, 李瑞芳, 付玉荣, 王红艳. TLR4/NF-κB信号通路在微小隐孢子虫感染中的作用机制[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2018, 36(4): 361-366.
[10]	方芬, 刘喆, 王桂军, 徐前明. Toll样受体4诱导感染微小隐孢子虫的小鼠树突状细胞功能的体外研究[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2017, 35(3): 265-269.
[11]	刘晓洁, 毛铁波, 周蕊. 固有免疫在微小隐孢子虫感染中的作用[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2017, 35(2): 185-192.
[12]	周耀武1，林祖锐1，程志斌2，郑直2，周兴武1，周子悠1，王多全3，李建雄1，曾旭灿1，孙晓东1*. 基于捕获与连接的探针式PCR矩阵拆分混样检测疟原虫的效果评价[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2016, 34(4): 20-330-333.
[13]	汲蕊，崔巍*，梁瑞文，管志玉，李瑞芳. 苦参合剂对微小隐孢子虫感染小鼠肠黏膜的保护作用[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2013, 31(4): 6-275-279.
[14]	高姗姗1,2，吴绍强3，罗静1，王承民1，张敏1，赵宝华2，何宏轩1 *. IMS-qPCR检测水源性微小隐孢子虫方法的建立[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2013, 31(3): 4-180-184.
[15]	刘媛1，薛峰1，2，黄敏君1，2，甘绍伯1，2，谷俊朝1，2 *. 应用生物素标记与蛋白质组学方法分离鉴定弓形虫表面蛋白和分泌蛋白[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2013, 31(1): 2-6-11.