中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ›› 2022, Vol. 40 ›› Issue (3): 305-308.doi: 10.12140/j.issn.1000-7423.2022.03.021
WANG Ting(), YANG Qing-li(
), LENG Jing, LI Bao-ying, SHEN Ji-qing, DAI Yue
摘要:
根据华支睾吸虫死亡细胞释放的高迁移率族蛋白1(CsHMGB1)同源分子编码序列构建pET-28a(+)表达质粒并转化至Rosetta(DE3)感受态细胞,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导CsHMGB1-His融合蛋白表达;Ni-TED琼脂糖树脂纯化蛋白后,蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析鉴定His标签融合蛋白表达情况。用含不同浓度(1 μg/ml和10 μg/ml)CsHMGB1-159/127的培养液与小鼠巨噬细胞RAW264.7共培养,同时设立无刺激物的空白对照组,培养24 h和48 h。用pNiFty2-SEAP质粒和HEK-BlueTM培养基检测SEAP活性代表核转录因子-κB(NF-κB)活化,用酶标仪检测培养上清吸光度(A620值),并在显微镜下观察细胞内蓝色显色反应。结果显示,分别表达出编码159和127个氨基酸的CsHMGB1-159/127蛋白,相对分子质量(Mr)约为23 500和20 000。1和10 μg/ml CsHMGB1-159蛋白刺激小鼠巨噬细胞24 h后的A620值分别为0.66 ± 0.08和0.65 ± 0.03,均高于对照组(0.29 ± 0.02)(t = 11.1、28.5,P < 0.01),且胞浆均出现明显蓝色;48 h后的A620值分别达1.02 ± 0.08和1.07 ± 0.08,均高于对照组(0.62 ± 0.035)(t = 11.2、12.9,P < 0.01),且胞浆蓝色加深。用1和10 μg/ml CsHMGB1-127蛋白刺激24 h后的A620值分别为0.52 ± 0.08和0.56 ± 0.08,均高于对照组(t = 7.39、8.37,P < 0.01),胞浆也出现明显蓝色;48 h后的A620值分别达到1.10 ± 0.05和0.90 ± 0.10,均高于对照组(t = 20.30、6.26,P < 0.01),胞浆蓝色也明显加深。1和10 μg/ml CsHMGB1-159蛋白刺激24 h后的A620值高于相应浓度的CsHMGB1-127蛋白(t = 2.98、2.75,P < 0.05);48 h后两种蛋白的A620值的差异有统计学意义(t = -2.07,P < 0.01;t = 3.40,P < 0.05)。CsHMGB1-159比CsHMGB1-127蛋白在体外均能够刺激小鼠巨噬细胞NF-κB活化,CsHMGB1-159比CsHMGB1-127蛋白的作用更强。
中图分类号: