王晓1,朱君1,吴亮1,吴腊梅1,刘原1,苏丹华1,丁宁1,赵康容1,姜旭淦1,陈盛霞1 * ,曹建平2
WANG Xiao1,ZHU Jun1,WU Liang1,WU La-mei1,LIU Yuan1,SU Dan-hua1,DING Ning1,ZHAO Kang-rong1,JIANG Xu-gan1,CHEN Sheng-xia1 *,CAO Jian-pin2
摘要:
目的 用Tet-on慢病毒载体系统构建稳定表达弓形虫棒状体蛋白18(ROP18)的293T细胞株。 方法 PCR扩增ROP18基因序列插入慢病毒载体pLVCT-tTR-KRAB中,构建带有ROP18活性片段的慢病毒载体pLVCT-tTR-KRAB-ROP18。经鉴定后将该重组载体(6 μg)与辅助质粒psPAX2(4 μg)和pMD2.G(2 μg)共同转染293T细胞,荧光显微镜下观察细胞荧光。于转染后48和72 h收集含有慢病毒颗粒上清液,感染293T细胞。以1 μg/ml强力霉素(DOX)诱导293T细胞表达ROP18,荧光显微镜下观察细胞荧光,RT-PCR法检测293T细胞中的ROP18表达情况。 结果 PCR扩增rop18片段为960 bp,与预期大小一致。经PCR和酶切鉴定重组慢病素载体构建成功。转染48 h后,293T细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光。经DOX诱导24 h即可观察到293T细胞中明亮绿色荧光。RT-PCR检测结果显示,293T细胞ROP18可产生960 bp特异条带,与预期结果一致。 结论 采用Tet?鄄on慢病毒载体系统构建了稳定表达弓形虫ROP18的293T细胞株。