微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白的原核表达及鉴定

摘要/Abstract

摘要： 目的对微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白S-dsRNA 基因进行克隆、表达和反应原性分析。方法以微小隐孢子虫总RNA逆转录的cDNA为模板，克隆S-dsRNA基因，并转化至原核表达载体pET-28a（+）中，构建重组原核表达载体pET-28a（+）-S，转入大肠埃希菌BL21（DE3）中，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）观察重组蛋白的表达情况，蛋白质印迹（Western blotting）分析重组蛋白与鼠抗微小隐孢子虫阳性血清的反应原性。结果 PCR和双酶切鉴定表明，重组质粒pET-28a（+）-S构建成功。SDS-PAGE 结果显示，37 ℃下经1 mmol/L IPTG 诱导4 h，重组蛋白表达量最大。重组蛋白主要以包涵体形式表达，相对分子质量（Mr）约为37 000，与预期大小一致，重组蛋白约占蛋白总量的72.6%。Western blotting分析结果表明，重组蛋白能识别抗微小隐孢子虫阳性鼠血清。结论微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白S-dsRNA 基因表达成功，重组蛋白具有反应原性。

关键词: 微小隐孢子虫, dsRNA 病毒, S-dsRNA, 原核表达

Abstract: Objective To clone and express S-dsRNA gene of Cryptosporidium parvum virus， and investigate the reactionogenicity of the recombinant. Methods Total RNA was extracted from Cryptosporidium parvum and S-dsRNA gene was amplified by RT-PCR. The PCR product was cloned into pET-28a（+） expression vector. The recombinant plasmid pET-28a（+）-S was transformed into E. coli BL21 （DE3） and induced with IPTG. The expression situation of recombinant protein was analyzed by SDS-PAGE. Its reactionogenicity was examined by Western blotting analysis. Results pET-28a（+）-S was identified by PCR and double endonuclease digestion. SDS-PAGE result showed that the recombinant protein （M_r37 000） was expressed in the form of inclusion body. High level expression of recombinant protein was found at 1 mmol/L IPTG condition after incubation at 37 ℃ for 4 h and reached up to 72.6 % of the total protein. The protein was recognized by the antisera from mice immunized with antigens from Cryptosporidium parvum oocysts. Conclusion The S-dsRNA gene of Cryptosporidium parvum virus has been expressed with adequate reactionogenicity.

Key words: Cryptosporidium parvum, dsRNA virus, S-dsRNA, Prokaryotic expression

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微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白的原核表达及鉴定

Prokaryotic Expression and Identification of S-dsRNA Gene from Cryptosporidium parvum Virus

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