中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ›› 2007, Vol. 25 ›› Issue (3): 2-170.
刘海鹏;曹建平;李小红;卢潍媛;沈玉娟;徐馀信;臧炜;刘述先
LIU Hai-peng;CAO Jian-ping;LI Xiao-hong;LU Wei-yuan;SHEN Yu-juan;XU Yu-xin;ZANG Wei;LIU Shu-xian
摘要: 目的 克隆、表达和分析安氏隐孢子虫Mr 70 000热休克蛋白(CaHSP70) 的部分编码基因。 方法 依据公布的CaHSP70基因序列设计引物,以江苏徐州安氏隐孢子虫(XZ-BOV)总RNA为模板,反转录PCR(RT-PCR)扩增目的编码基因。PCR产物经TA克隆后,亚克隆入pET28a原核表达载体,构建重组质粒pET28a-CaHSP70,转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并获得纯化的重组蛋白(简称为rCaHSP70)。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹(Western blotting)和ELISA对该重组蛋白进行分析和鉴定。采用相关生物信息学软件对序列进行分析。 结果 根据克隆的目的基因序列推导的氨基酸序列与GenBank登录的CaHSP70一致。SDS-PAGE和Western blotting分析显示,重组蛋白(rCaHSP70) Mr约为43 000(含6个组氨酸),以包涵体的形式存在,可被辣根过氧化物酶标记的抗组氨酸抗体、安氏隐孢子虫感染的小鼠血清、微小隐孢子虫感染的儿童血清和rCaHSP70免疫小鼠血清识别。rCaHSP70存在多个功能位点和潜在的抗原决定簇。种系发生分析表明XZ-BOV与安氏隐孢子虫进化关系最近。ELISA检测结果表明,rCaHSP70免疫的C57BL/6小鼠与BALB/c小鼠血清特异性抗体滴度均显著高于免疫前。 结论 XZ-BOV HSP70部分编码基因的克隆获得成功,研究获得的重组蛋白具有一定的免疫原性和免疫反应性。