河南省输入性恶性疟原虫多药抗性基因1和K13基因的突变分析

摘要/Abstract

摘要：

目的对河南省2013-2015年输入性恶性疟原虫多药抗性基因1（Pfmdr1）和K13基因进行检测,分析其基因突变情况。方法采集河南省2013-2015年自非洲返乡的被确诊为输入性恶性疟患者的血样,并收集病例的相关信息。提取患者血样中疟原虫基因组DNA,巢式PCR扩增Pfmdr1和K13基因,对扩增序列进行测序、比对,分析基因的突变情况。结果 386例输入性恶性疟患者以男性青壮年为主,自26个非洲国家返乡,其中病例数居前3位的输入来源国为安哥拉、赤道几内亚和尼日利亚,其病例数分别占总病例数的22.5%（87/386）、13.7%（53/386）和13.2%（51/386）。386份血样均成功扩增出Pfmdr1和K13基因。测序结果显示,Pfmdr1的86和1246位点的突变率分别为23.6%（91/386）和3.1%（12/386）,K13基因的突变率为5.4% (21/386）。21份K13基因突变的血样来自于安哥拉、赤道几内亚和尼日利亚等10个国家,未发现C580Y突变。在来自安哥拉和赤道几内亚的血样中检测到2个与青蒿素抗性相关的突变,分别为R539T和P574L,突变率均为0.3%(1/386)。2013-2015年,Pfmdr1的86位点的突变率分别为28.8%（36/125）、23.4% (32/137)和18.6% (23/124),各年份突变率的差异有统计学意义（χ² = 6.438,P < 0.05）;1246位点突变率分别为4.0%（5/125）、3.7%（5/137）和1.6%（2/124）,各年份突变率的差异无统计学意义（χ² = 1.384,P > 0.05）;K13基因的突变率分别为3.2%（4/125）、8.8%（12/137）和4.0%（5/124）,各年份突变率的差异无统计学意义（χ² = 4.631,P > 0.05）。结论 Pfmdr1的86和1246位点的突变率分别为23.6%（91/386）和3.1%（12/386）,K13基因的突变率为5.4%（21/386）,发现了与青蒿素抗性相关的R539T和P574L位点突变。

关键词: 输入性疟疾, 恶性疟原虫, 恶性疟原虫多药抗性基因1, K13基因, 突变

Abstract:

Objective To identify mutations of Plasmodium falciparum multidrug resistance gene 1 （Pfmdr1） and K13 gene in imported P. falciparum in Henan Province during 2013-2015. Methods Blood samples and epidemiological information were collected from 386 workers returning from Africa, who were diagnosed as imported falciparum malaria in Henan Province during 2013-2015. Plasmodium DNA was extracted, followed by nested PCR to amplify the Pfmdr1 and K13 gene. The PCR products were sequenced and sequence alignment was carried out to analyze gene mutations. Results The 386 patients returned from 26 African countries and were predominantly males. The top 3 disease-exporting counties were Angola (22.5%, 87/386), Equatorial Guinea (13.7%, 53/386), and Nigeria (13.2%, 51/386). Pfmdr1 and K13 genes were amplified from all the 386 blood samples. Sequencing results indicated mutation rate of 23.6% (91/386) and 3.1% (12/386) at loci 86 and 1246 of Pfmdr1, respectively, and 5.4% (21/386) for K13 gene. The 21 blood samples with K13 gene mutations were from 10 countries, in which no C580Y mutation was found, but the R539T and P574L mutations (0.3%, 1/386 for each), which are associated with artemisinin resistance, were found in samples from Angola and Equatorial Guinea. The mutation rate for Pfmdr1 locus 86 was 28.8% (36/125), 23.4% (32/137) and 18.6% (23/124) in each year during 2013-2015, respectively (χ² = 6.438, P < 0.05), and that for locus 1246 was 4.0% (5/125), 3.7% (5/137), 1.6% (2/124), respectively (χ² = 1.384, P > 0.05). The mutation rate of K13 gene was 3.2% (4/125), 8.8% (12/137) and 4.0% (5/124) in each year during 2013-2015, respectively (χ² = 4.631, P > 0.05). Conclusion The mutation rate at loci 86 and 1246 of Pfmdr1 is 23.6% (91/386) and 3.1% (12/386), respectively, and that of K13 gene was 5.4% (21/386). Besides, two mutations R539T and P574L associated with artemisinin resistance are detected.

Key words: Imported malaria, Plasmodium falciparum, Plasmodium falciparum multidrug resistance gene 1, K13 gene, Mutation

中图分类号:

R382.312

杨成运, 李素华, 张雅兰, 周瑞敏, 刘颖, 钱丹, 赵玉玲, 许汴利, 张红卫, 邓艳. 河南省输入性恶性疟原虫多药抗性基因1和K13基因的突变分析[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2018, 36(2): 97-102.

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图/表 4

表1

图1

表2

河南省输入性恶性疟原虫多药抗性基因1和K13基因位点突变的分布

基因 Gene	突变位点 Mutation position	突变病例数 No. cases with mutation	来源国（病例数） Source country （No. cases）
K13	R471R	2	安哥拉Angola（2）
	R539T	1	安哥拉Angola（1）
	M579I	1	安哥拉Angola（1）
	Q613E	2	安哥拉Angola（1）, 刚果金Congo, DRC （1）
	N664D	1	津巴布韦Zimbabwe （1）
	A578S	2	乌干达Uganda （1）, 几内亚Guinea （1）
	F662C/N664D	1	贝宁Benin （1）
	N629S	1	利比里亚Liberia （1）
	E556K/D648Y	1	塞拉利昂Sierra Leone （1）
	G496G	1	尼日利亚Nigeria （1）
	K610R	1	尼日利亚Nigeria （1）
	P574L	1	赤道几内亚Equatorial Guinea （1）
	M476I/V589I	1	赤道几内亚Equatorial Guinea （1）
	L663V	1	赤道几内亚Equatorial Guinea （1）
	K658Q	1	赤道几内亚Equatorial Guinea （1）
	A578T/M579I	1	赤道几内亚Equatorial Guinea （1）
	D464N	1	赤道几内亚Equatorial Guinea （1）
	N664N	1	赤道几内亚Equatorial Guinea （1）
Pfmdr1	86位点 Locus 86	91	尼日利亚Nigeria （11）, 苏丹Sudan （2）, 利比亚Libya （2）, 赞比亚Zambia （2）, 安哥拉Angola（11）, 肯尼亚Kenya （1）, 坦桑尼亚Tanzania（1）, 乍得Chad（1）, 马里Mali（1）, 多哥Togo （2）, 贝宁Benin （1）, 喀麦隆Cameroon （7）, 加蓬Gabon （2）, 赤道几内亚Equatorial Guinea （20）, 刚果金Congo, DRC （2）, 刚果布Congo （1）, 利比里亚Liberia （10）, 加纳Ghana （1）, 塞拉利昂Sierra Leone （4）, 几内亚Guinea （8）
	1246位点 Locus 1246	12	利比亚Libya （2）, 肯尼亚Kenya （1）, 利比里亚Liberia （3）, 刚果金Congo, DRC （1）, 喀麦隆Cameroon （2）, 塞拉利昂Sierra Leone （1）, 安哥拉Angola（1）
	86/1246位点 Locus 86/1246	11	利比亚Libya （2）, 肯尼亚Kenya （1）, 利比里亚Liberia （3）, 刚果金Congo, DRC （1）, 喀麦隆Cameroon （2）, 塞拉利昂Sierra Leone （1）
K13/Pfmdr1	K13/86位点 K13/Locus 86	5	利比里亚Liberia （1）, 几内亚Guinea （1）,尼日利亚Nigeria （1）, 赤道几内亚Equatorial Guinea （2）
	K13/86/1246位点 K13/Locus 86/1246	1	利比里亚Liberia （1）

表2

表3

参考文献 24

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基因 Gene	位点 Locus	引物 Primer	引物序列(5′→3′) Sequence (5′→3′)	片段长度/bp Fragment length/bp
Pfmdr1	86	P1	TTAAATGTTTACCTGCACAACATAGAA AATT	520
		P2	CTCCACAATAACTTGCAACAGTTCTTA
		N1	TGTATGTGCTGTATTATCAGGA
		N2	CTCTTCTATAATGGACATGGTA
	1246	P3	GGGGGATGACAAATTTTCAAGATTA	203
		P4	GGGGGACTAACAAGTTTAACATCTT
		N3	AATGTAAATGAATTTTCAAACC
		N4	CATCTTCTCTTCCAAATTTGATA
K13		P5	GCCTTGTTGAAAGAAGCAGAA	751
		P6	CGCCATTTTCTCCTCCTGTA
		N6	GTGGCAGCTCCAAAATTCAT