中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ›› 2020, Vol. 38 ›› Issue (1): 41-46.doi: 10.12140/j.issn.1000-7423.2020.01.007
沈双1,*, 罗军涛2, 叶建平1
SHEN Shuang1,*, LUO Jun-tao2, YE Jian-ping1
摘要: 目的 探索Beclin1在血吸虫病肝纤维化中与线粒体功能的关系。 方法 将40只C57BL/6雌性小鼠随机分为感染组和健康对照组,每组20只。感染组小鼠采用腹部贴片法感染日本血吸虫尾蚴20条/鼠。感染后10周,取两组小鼠新鲜肝组织,苏木精-伊红(HE)和Masson染色观察肝组织病变情况。蛋白质印迹(Western blotting)分析肝组织中Beclin1、p-Beclin1及电压依赖型阴离子孔道蛋白1(VDAC1)的相对表达水平。荧光定量PCR检测肝组织中胶原蛋白Col 1a1、Col 3a1,以及肝组织中参与线粒体柠檬酸循环反应的柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、α酮戊二酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶mRNA的相对转录水平。取两组小鼠肝组织制备切片,电镜下观察线粒体形态。提取肝组织线粒体,利用细胞能量代谢仪依次检测加入复合物Ⅴ底物二磷酸腺苷(ADP)、复合物Ⅴ抑制剂寡霉素、解偶联剂FCCP、复合物Ⅱ和Ⅲ的抑制剂抗霉素A后5 min线粒体的耗氧率。 结果 HE和Masson染色结果显示,感染组小鼠肝脏形成肉芽肿,肉芽肿区域发生明显纤维化。Western blotting分析结果显示,感染组肝组织中VDAC1表达水平未发生改变;Beclin1和p-Beclin1的相对表达水平分别为0.65 ± 0.05、0.78 ± 0.03,均较健康对照组下降(P < 0.05)。荧光定量PCR结果显示,感染组小鼠肝组织中Col 1a1、Col 3a1 mRNA的相对转录水平分别为4.05 ± 0.23、2.71 ± 0.14,均较健康对照组上升(P < 0.01);柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、α酮戊二酸脱氢酶及苹果酸脱氢酶mRNA的相对转录水平分别为0.61 ± 0.03、0.65 ± 0.01、0.41 ± 0.03、0.55 ± 0.01,均较健康对照组下降(P < 0.01)。电镜观察可见,感染组肝组织线粒体结构受损,嵴断裂。线粒体功能检测显示,加入复合物Ⅴ底物ADP后,健康对照组和感染组耗氧率分别为(335 ± 29)、(78 ± 23)pmol/min,差异有统计学意义(P < 0.01);加入复合物Ⅴ抑制剂寡霉素后,健康对照组和感染组耗氧率分别为(80 ± 2)、(31 ± 6)pmol/min,两组耗氧率差异减小但仍有统计学意义(P < 0.05);加入解偶联剂FCCP后,健康对照组和感染组耗氧率分别为(159 ± 4)、(42 ± 5)pmol/min,差异有统计学意义(P < 0.01);加入复合物Ⅱ和Ⅲ的抑制剂抗霉素A后,两组耗氧率均降为0。 结论 血吸虫病肝纤维化过程中,Beclin1表达量下降,柠檬酸循环受到抑制,线粒体耗氧率进一步下降。线粒体复合物Ⅴ是血吸虫病肝纤维化过程中线粒体活性调节的关键复合物。
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